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Sep 11, 2023

PP2A

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12720 (2023) Citar este artículo Detalles de las métricas Para el mantenimiento de la integridad y función epidérmica son fundamentales las conexiones entre los intermediarios.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12720 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Para el mantenimiento de la integridad y función epidérmica son fundamentales las uniones entre los filamentos intermedios (IF) y las uniones intercelulares llamadas desmosomas. La proteína desmoplaquina (DP) de la placa citoplasmática desmosómica es esencial para anclar el IF a la unión. Las interacciones DP-IF están reguladas por un motivo fosforregulador dentro del extremo C terminal de DP que controla la adhesión intercelular de los queratinocitos. Aquí identificamos la holoenzima proteína fosfatasa 2A (PP2A) -B55α como la principal serina/treonina fosfatasa que regula el extremo C de DP y la consiguiente adhesión intercelular. Utilizando una combinación de enfoques químicos y genéticos, mostramos que la holoenzima PP2A-B55α interactúa con DP en las membranas intercelulares en modelos epidérmicos 2D y 3D y muestras de piel humana. Nuestros experimentos demuestran que PP2A-B55α regula el estado de fosforilación del DP de unión y es necesario para mantener una fuerte adhesión intercelular mediada por desmosomas. Estos datos identifican a PP2A-B55α como parte de un módulo regulador capaz de ajustar la fuerza de adhesión intercelular y un objetivo de enfermedad candidato en trastornos de la piel y el corazón relacionados con los desmosomas.

Las uniones de adhesión intercelular asociadas al citoesqueleto son esenciales para mantener la estabilidad de los tejidos multicelulares y proporcionar a las células la integridad estructural necesaria para resistir el entorno mecánico cambiante del tejido. Esto es particularmente importante en tejidos que experimentan altos niveles externos o internos de estrés mecánico, como la epidermis estratificada o el corazón. Particularmente importantes para estos tejidos son los desmosomas, uniones intercelulares que integran estímulos químicos y mecánicos para permitir la regulación dinámica del citoesqueleto cortical1,2.

El desmosoma comprende cadherinas transmembrana de dos familias, desmogleínas (Dsg) y desmocolinas (Dsc), dos proteínas de armadillo de placa, placofilina (Pkp) y plakoglobina (PG), y una proteína conectora citoesquelética de filamento intermedio (IF), desmoplaquina (DP). Al unir el citoesqueleto del IF a la membrana plasmática, la DP fortalece la adhesión y distribuye las fuerzas por los tejidos1,2. A diferencia de las familias Dsg, Dsc y Pkp, que están reguladas por expresión de isoformas en capas diferenciadas específicas en la epidermis estratificada, DP es la única proteína plaquina desmosoma y, por lo tanto, se expresa de manera ubicua en todas las células formadoras de desmosomas. La naturaleza esencial de la DP se destaca mejor por el fenotipo letal embrionario de los ratones con DP nula y los defectos graves exhibidos en los tejidos de alta tensión, incluidos la piel y el corazón, de los ratones tetraploides de rescate y knockout epidérmicos específicos4,5,6. Además, las mutaciones en el gen DSP dan como resultado una variedad de trastornos, desde epidermólisis ampollosa acantolítica letal (LAEB) hasta queratodermia palmar plantar estriada (SPPK), así como miocardiopatía arritmogénica (AC) y síndrome cardiocutáneo de Carvajal7,8,9,10,11. ,12,13.

En particular, la DP está regulada en parte por la fosforilación procesiva de una repetición de glicina-serina-arginina en su extremo C directamente aguas abajo del sitio de unión de DP-IF (Fig. 1A)14,15. Trabajos anteriores de nuestro grupo y otros han caracterizado la forma hipofosforilada de DP por tener una mayor afinidad de unión a IF que afecta la formación, dinámica y función de los desmosomas14,16,17,18. Específicamente, la expresión de mutantes DP constitutivamente hipofosforilados aumentó la fuerza de adhesión y la rigidez del tejido, lo que dio como resultado láminas de células epidérmicas capaces de soportar un mayor estrés mecánico17,18,19. Anteriormente se identificó que la fosforilación del motivo fosforregulador de DP era desencadenada por la actividad coordinada de la glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK3β) y la proteína arginina metiltransferasa 1 (PRMT-1)14. A pesar de la importancia de la forma hipofosforilada de DP en el fortalecimiento de la unión de IF, la fosfatasa responsable de desfosforilar la DP seguía siendo desconocida.

PP2A es una fosfatasa para el dominio C-terminal de DP. (A) Esquema de los dominios estructurales de DP y la construcción DP-S-Tag que contiene solo los residuos 2628–2871. A continuación se destaca el motivo fosforregulador repetido "GSR" de 68 residuos de longitud aguas abajo del sitio de unión de IF capaz de regular las interacciones DP-IF. (B) Un gel de acrilamida al 15% sin (izquierda) y con (derecha) molécula Phos-Tag capaz de separar proteínas por su número de grupos fosfato. Los lisados ​​​​de proteínas provienen de células SCC9 transfectadas con el extremo C de la etiqueta DP-S y tratadas con LiCl u OA durante 3 h. El gel Phos-Tag se analizó utilizando un anticuerpo anti-S-Tag para visualizar la expresión total de DP-S-Tag. La cuantificación del % de DP-Stag fosforilado está a la derecha. El porcentaje de hiperfosforilado se calculó mediante (señal fosforilada/señal total)*100 para obtener un porcentaje final. (C – F) Los SCC9 se trataron con inhibidores preferenciales para PP2A (OA 50 y 100 nM) o PP1 (tautomicina 250 nM) durante 3 h. Análisis de transferencia Western de DP fosforilado S2849 (pDP) (C) y DP fosforilado dual S2845/S2849 (ppDP) (D). (E) Tinción de inmunofluorescencia de S2849 DP fosforilado (pDP) en SCC9 tratados con fármacos. (F) La intensidad de la tinción de [E] se cuantificó en la membrana utilizando tinción PG como máscara. (G) Se analizó la cantidad de DP fosforilado dual S2845/S2849 (ppDP) en células SCC9 totales transfectadas con ARNip dirigido a la subunidad PP2A-C. Los análisis estadísticos se realizaron sobre datos normalizados utilizando ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples (B-F) o una prueba t de Student (G). * < 0,05; ** < 0,01; *** < 0,001.

Este estudio identifica la holoenzima proteína fosfatasa 2A (PP2A) -B55α como la fosfatasa responsable de desfosforilar el extremo C de DP. Utilizando una combinación de enfoques químicos y genéticos, mostramos que la inhibición de la holoenzima PP2A-B55α induce un aumento en la fosforilación de DP en los sitios de uniones intercelulares. Además, encontramos que la subunidad reguladora B55α de PP2A está asociada con DP en las membranas intercelulares donde la localización de DP y B55α depende de la expresión del otro. Por último, los ensayos de adhesión intercelular de queratinocitos mostraron que la pérdida de la holoenzima PP2A-B55α disminuye la fuerza de adhesión intercelular mediada por el fosfomotivo DP C-terminal. En conjunto, estos datos revelan la existencia de un módulo regulador no reconocido previamente capaz de ajustar la adhesión dependiente de desmosomas. Proponemos que este módulo proporcione un mecanismo para las adaptaciones rápidas necesarias para mantener una barrera funcional en el entorno mecánico dinámico de la epidermis.

La importancia de la DP hipofosforilada para estabilizar la interacción DP-IF para fortalecer la adhesión mediada por desmosomas sugiere la existencia de una fosfatasa que desfosforila la DP en una materia regulada. Para determinar si las proteínas fosfatasas de serina/treonina están involucradas en este proceso, los queratinocitos se trataron con el inhibidor de la fosfatasa de panserina/treonina ácido okadaico (OA). Para permitir comparaciones con datos anteriores que identifican a GSK3β y PRMT-1 como reguladores de la fosforilación del extremo C de DP, inicialmente elegimos utilizar la línea celular de carcinoma de células escamosas SCC914. Las células SCC9 se transfectaron con una forma truncada de DP de 32 kDa (DP-S-Tag, Fig. 1A) que contenía solo su dominio C-terminal, incluidos los residuos 2628–287114. Las células que expresan DP-S-Tag se trataron con OA 100 nM, OA 250 nM o control de vehículo DMSO durante 3 h. Como control interno, las células se trataron con 40 mM de cloruro de litio (LiCl), un inhibidor de GSK3β conocido por inducir un extremo C terminal de DP hipofosforilado14. Los lisados ​​​​celulares se recogieron y se procesaron en geles que contenían un péptido Phos-tag capaz de separar proteínas en función del número de grupos fosfato presentes20. El gel Phos-tag mostró que el tratamiento con LiCl indujo un aumento de DP hipofosforilado, como se evidencia por una acumulación de la banda DP-S-Tag más baja (Fig. 1B). El tratamiento con OA 100 nM aumentó la intensidad de la segunda banda desde la parte inferior, lo que representa un aumento en el DP parcialmente fosforilado, mientras que el tratamiento con OA 250 nM resultó en una acumulación de bandas superiores de S-Tag que representan el DP hiperfosforilado. La cuantificación del gel Phos-Tag se realizó determinando la señal total de DP S-tag y la señal de DP Stag hiperfosforilada, y el porcentaje de hiperfosforilado se calculó mediante (señal hiperfosforilada/señal total)*100 para obtener un resultado final. porcentaje.

Para identificar la fosfatasa involucrada en la desfosforilación del extremo C de DP, empleamos inhibidores químicos dirigidos a las dos principales proteínas fosfatasas de serina/treonina que en conjunto representan aproximadamente el 90% de toda la actividad de la serina/treonina fosfatasa en los queratinocitos, PP2A y PP1. Si bien los inhibidores de la fosfatasa exhiben reactividad cruzada en sus sustratos, su selectividad preferencial permite una inhibición diferencial de PP2A y PP1. La OA inhibe preferentemente PP2A (IC50 = ~ 0,1 nM) con una afinidad 10 veces mayor que su siguiente objetivo principal, PP1 (IC50 = ~ 15 nM), mientras que la tautomicina inhibe preferentemente PP1 (PP1 IC50 = ~ 0,2 nM, PP2A IC50 = ~ 1 nM). )21. Por lo tanto, las células SCC9 se trataron con OA 100 nM, tautomicina 250 nM o control de vehículo DMSO durante 3 h. Se usó un fosfoanticuerpo específico para el sitio S2849 en el extremo C de DP como lectura para la fosforilación del extremo C de DP. El tratamiento con OA, pero no con tautomicina, aumentó los niveles de DP fosforilada en los lisados ​​​​celulares totales (Fig. 1C). Además, la inhibición de PP2A indujo un aumento en una forma de DP fosforilada dual medida utilizando un anticuerpo dirigido a los residuos S2845 y S2849 dentro del extremo C de DP (Fig. 1D), lo que coincide con el papel de PP2A en la regulación de múltiples residuos dentro del C-terminal. -cascada terminal de fosfo-serina.

Para determinar si la inhibición de PP2A afecta la fosforilación de DP en las uniones célula-célula, se realizó tinción por inmunofluorescencia de DP fosforilada y total en SCC9 tratados con fármaco durante 3 h. Como la dosis más alta de OA 100 nM afectó negativamente a la morfología celular y los contactos celulares, se usó una dosis más baja, OA 50 nM, que no tenía toxicidad visible ni efectos morfológicos junto con tautomicina 250 nM. Incluso con OA 50 nM, la cantidad de DP fosforilado en las membranas célula-célula aumentó casi el doble, mientras que la tautomicina 250 nM no tuvo un impacto detectable en el nivel de DP fosforilado en la membrana celular (Fig. 1E-F). Además, no hubo cambios detectables en la cantidad total de DP asociado a la membrana, lo que sugiere que los cambios detectados fueron específicos de la fosforilación de DP. Esto es consistente con los datos generados en la línea celular de queratinocitos no transformados inmortalizados espontáneamente HaCaT (Figura complementaria 1A), así como en células primarias de queratinocitos epidérmicos humanos neonatales (NHEK) (Figura complementaria 1B). Para confirmar aún más que los efectos sobre la fosforilación de DP eran específicos de la actividad de PP2A, se transfectaron células SCC9 con ARNip dirigido a la subunidad catalítica de PP2A (PP2A-C) o una secuencia de control Scramble y se cultivaron en confluencia durante 2 días. De manera similar al tratamiento con OA, la eliminación de PP2A-C aumentó el nivel de DP fosforilada dual (Fig. 1G). Esto se mantuvo constante en las células HaCaT donde la eliminación de PP2A-C aumentó los niveles de fosfo-S2849 DP en las membranas celulares (Figura complementaria 2). Con base en estos datos iniciales que sugieren que PP2A, y no PP1, es responsable de regular el extremo C terminal de DP, nos centramos en dilucidar aún más la relación PP2A-DP.

DP se encuentra en complejo con la subunidad reguladora B55⍺ de PP2A en las células SCC9. (A) Inmunoprecipitación de DP endógeno utilizando anticuerpos dirigidos al extremo C o N del DP y transferencia para Dsg3 o B55⍺. Las SCC9 (izquierda) y las NHEK (derecha) se cultivaron durante 2 días en medios ricos en calcio (HCM). (B) Inmunoprecipitación de B55⍺ endógena y transferencia para DP o Dsg3. Las SCC9 (izquierda) y las NHEK (derecha) se cultivaron durante 2 días en medios ricos en calcio (HCM). (C) Inmunofluorescencia SCC9 teñida conjuntamente para B55⍺, DP y ⍺-Catenina. A continuación se muestran imágenes superpuestas. Análisis de colocalización determinado por una herramienta de análisis de colocalización basada en objetos representada como mediciones de coeficientes de superposición. (D) Análisis de ligadura de proximidad realizado en células SCC9 transfectadas con ARNip dirigido a un control Scramble, B55α o DP. Se midió una señal de PLA basada en fluorescencia en cubreobjetos fijos incubados con anticuerpos dirigidos a B55α y DP. (E) Tinción por inmunofluorescencia de DP fosforilado (pDP) de S2849 en células SCC9 transfectadas con ARNip dirigido a la subunidad B55α. La intensidad de la tinción se cuantificó en la membrana utilizando tinción PG como máscara. (F) Se analizó la cantidad de DP fosforilado dual S2845/S2849 (ppDP) en células SCC9 totales transfectadas con ARNip dirigido a la subunidad B55α. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples (A,D) o una prueba t de Student (B–C,E–F). * < 0,05; ** < 0,01; *** < 0,001.

PP2A es una proteína heterotrimérica que comprende una subunidad de andamiaje (A), una subunidad catalítica (C) y una subunidad reguladora (B). Para formar la holoenzima, las subunidades A y C se unen a una de las 23 isoformas diferentes de la subunidad B que son responsables de unir los sustratos22. Para comprender mejor cómo PP2A regula la DP, buscamos identificar la subunidad B responsable de dirigir PP2A a DP. En un estudio proteómico imparcial, se identificó que DP se une a la subunidad B B55α23. Además, tanto en modelos de células como de ratones, la pérdida de B55α resultó en un desarrollo deficiente de la barrera epidérmica24,25,26,27. Con base en estos informes, nos propusimos abordar el grado en que B55α y DP se asocian en los queratinocitos.

Con este fin, se realizó un ensayo de co-inmunoprecipitación (co-IP) para derribar complejos de DP endógenos utilizando dos anticuerpos diferentes dirigidos a DP dirigidos a los extremos C y N de DP en células SCC9 y NHEK. Tanto el C como el N-terminal, los anticuerpos dirigidos, derribaron la cadherina desmosómica Dsg3 como se esperaba. Además, B55α también se enriqueció en ambos complejos IP en comparación con el control de IgG (Fig. 2A). Un co-IP que utiliza un anticuerpo dirigido a B55α endógeno resultó de manera similar en un enriquecimiento en DP en comparación con el control, pero curiosamente no se enriqueció en Dsg3, lo que sugiere que B55α puede interactuar preferentemente con DP (Fig. 2B).

Para observar la posible colocalización de B55α-DP, se realizó inmunofluorescencia en células SCC9 que tiñeron conjuntamente B55α con DP u otra proteína asociada a la membrana, incluida la proteína α-catenina del conector citoesquelético de la unión adherente. La tinción con B55α se parecía más a la localización de DP que a la α-Catenina (Fig. 2C). La colocalización se cuantificó utilizando una herramienta de análisis basada en objetos, revelando una colocalización significativamente mayor entre B55α/DP que B55α/α-catenina28. La tinción de células SCC9 transfectadas con ARNip dirigido a B55α confirmó que la señal de B55α localizada en la membrana es específica de la proteína B55α (Figura complementaria 3A). En particular, la pérdida de B55α se asoció con una disminución en la cantidad total de DP en la membrana celular, lo que sugiere que B55α puede regular la dinámica de DP (Figura complementaria 3A). Además, la pérdida de DP coincidió con la pérdida de B55α asociada a la membrana, lo que respalda la idea de que B55α está físicamente anclado a DP en la membrana.

B55alfa se encuentra localizado en sitios de membranas intercelulares en la epidermis 3D in vitro e in vivo. (A – B) Cultivos de piel reconstruidos organotípicos en 3D cultivados durante 6 días en cultivo y tinción por inmunofluorescencia de B55⍺, DP y PG (A) y B55⍺, α-Catenina y PG (B). (C) Análisis de colocalización de (A – B) según lo determinado por una herramienta de análisis de colocalización basada en objetos representada como mediciones de coeficientes de superposición. (D) Se tiñeron muestras de piel humana para B55⍺ y DP mediante inmunofluorescencia. (E) Análisis de colocalización de (D) y (Fig. 4D complementaria) según lo determinado por una herramienta de análisis de colocalización basada en objetos representada como mediciones de coeficientes de superposición. (F – G) Análisis de ligadura de proximidad realizado en muestras de piel humana fijadas. Se midió una señal de PLA basada en fluorescencia en portaobjetos fijos incubados con anticuerpos dirigidos a B55α y DP o B55α e IgG. Los análisis estadísticos se realizaron mediante una prueba t de Student. * < 0,05; ** < 0,01.

Para validar esta interacción en las células, se realizó un ensayo de ligadura por proximidad (PLA) utilizando anticuerpos dirigidos a B55α y DP en SCC9 transfectados con ARNip dirigidos a un control Scramble, B55α o DP29. De acuerdo con el análisis de colocalización, el PLA produjo una señal significativa en las células de control Scramble que se perdió con la eliminación de B55α o DP, lo que confirma que la señal de PLA se debe a la proximidad entre las dos proteínas dentro de las células (Fig. 2D). Figura complementaria 3B). Para determinar la importancia funcional del complejo DP-B55α, se transfectaron células SCC9 con ARNip dirigido a B55α y se cultivaron en confluencia durante 2 días. La tinción por inmunofluorescencia dio como resultado un aumento en la DP fosforilada de S2849 en las membranas celulares (Fig. 2E, Fig. Suplementaria 3C). Además, el análisis de transferencia Western confirmó que la eliminación de B55α aumentó el nivel de DP fosforilado dual en las células (Fig. 2F).

Para determinar si también existe un complejo B55α/DP en los tejidos, se tiñó conjuntamente un modelo de balsa epidérmica reconstruida organotípicamente en 3D cultivado durante 6 días para B55α y DP. De acuerdo con los datos celulares, se encontró B55α localizado en la membrana en un patrón que se parece más a DP que a PG o α-Catenina (Fig. 3A-B, Fig. Suplementaria 4A). Además, el análisis de colocalización basado en objetos reveló que B55α tenía un coeficiente de superposición más alto con DP que con PG o α-Catenin (Fig. 3C, Fig. Suplementaria 4B). La tinción de muestras de piel humana también mostró B55α preferentemente colocalizada con DP en la membrana dentro de la epidermis intacta, lo que sugiere que esta interacción se mantiene in vivo (Fig. 3D – E, Fig. Suplementaria 4C – D). Para interrogar más directamente la interacción B55α-DP in vivo, se realizó PLA en muestras de piel humana usando sondas dirigidas B55α y DP y se comparó con muestras tratadas con anticuerpo B55α o IgG sola. De acuerdo con los datos celulares, la señal de PLA se detectó de manera sólida en comparación con los controles, lo que respalda aún más la conclusión de que B55α está en complejo con DP dentro de la epidermis estratificada intacta (Fig. 3F-G).

PP2A-B55alfa regula la adhesión y barrera de las células epiteliales a través de DP. (A) Se realizó un ensayo de adhesión de dispasa en SCC9 transfectadas con ARNip dirigido a Scramble, B55⍺ o DP y cultivadas en HCM normal durante 5 días. Las imágenes representan monocapas de SCC9 antes (izquierda) y después (derecha) de la exposición al estrés mecánico. (B) La fragmentación de monocapa de (A) se cuantificó y se representó como número total de fragmentos de n = 5. (C) Validación por transferencia Western de la eliminación de ARNip en (A). (D) Se realizó un ensayo de adhesión de dispasa en células A431 que expresaban DPserGFP o DPglyGFP inducible por dox y se transfectaron con ARNip dirigido a Scramble, B55⍺ o DP. Las células se cultivaron en HCM normal con 1 μg/ml de Dox durante 6 días. Las imágenes representan monocapas de A431 antes (izquierda) y después (derecha) de la exposición a tensión mecánica. (E) La fragmentación de monocapa de (A) se cuantificó y se representó como número total de fragmentos de n = 4. (F) Validación por transferencia Western de la eliminación de ARNip en (C). Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples. * < 0,05; ** < .01.

Nuestro grupo informó anteriormente que la expresión ectópica del extremo C terminal de DP constitutivamente hipofosforilado aumenta la fuerza de adhesión17. Por lo tanto, estábamos interesados ​​en identificar el papel de PP2A-B55α en la regulación de la adhesión de queratinocitos a través de la fosforregulación de DP. Se realizó un ensayo de adhesión basado en dispasa en células SCC9 en las que se eliminó la subunidad catalítica PP2A (PP2A-C) o la subunidad reguladora B55α utilizando ARNip. Las células se cultivaron durante 5 días en monocapas totalmente confluentes y se utilizó un tratamiento de dispasa para levantar las monocapas celulares de la placa de cultivo antes de transportar las monocapas a tubos para sufrir una perturbación mecánica mediante inversión. La fuerza de adhesión se determinó registrando el nivel de fragmentación de las monocapas. El silenciamiento de PP2A-C o B55α resultó en una cantidad significativamente mayor de fragmentos de monocapa en comparación con los controles (Fig. 4A-C). En particular, las células tratadas con siDP dieron como resultado una fragmentación completa de las monocapas celulares, lo que sugiere que la pérdida de PP2A-B55α solo altera parcialmente la función de DP.

Para determinar en qué medida los efectos de la pérdida de PP2A-B55α en la adhesión se debieron a su fosforregulación del extremo C terminal de DP, utilizamos células A431 que expresan una construcción DP-GFP inducible por dox que expresa DP de tipo salvaje (DPserGFP) o un mutante S2849G DP constitutivamente hipofosforilado (DPglyGFP)17. Las células A431 se transfectaron con ARNip dirigido a un control Scramble, PP2A-C o B55α. Después de la transfección, las células se cultivaron en confluencia en medios que incluían 1 μg/ml de dox durante 6 días antes de que se recogieran las monocapas utilizando un tratamiento con dispasa y se sometieran a rotación mecánica. De acuerdo con los datos de SCC9, la eliminación de PP2A-C y B55α aumentó la fragmentación en las células que expresan DPserGFP (Fig. 4D-F). Además, de acuerdo con informes anteriores, la expresión de DPglyGFP resultó en una menor fragmentación en las células de control Scramble en comparación con la expresión de DPserGFP. Sin embargo, la eliminación de PP2A-C y B55α no tuvo efecto sobre la fragmentación en las células que expresan DPglyGFP, lo que sugiere que la capacidad de PP2A-B55α para regular la adhesión de queratinocitos depende de la fosforregulación del extremo C terminal de DP. En conjunto, estos estudios presentan PP2A-B55α como un módulo molecular capaz de modificar la fuerza adhesiva de los queratinocitos en respuesta a sus entornos mecánicos cambiantes.

Al identificar la fosfatasa que actúa sobre el motivo fosfo en el extremo C terminal de DP, hemos llenado un vacío importante en nuestra comprensión de cómo se sintoniza la conexión del filamento intermedio del desmosoma mediante la regulación del estado de fosforilación de DP. Nuestro trabajo muestra que la holoenzima PP2A-B55α está asociada con el conector citoesquelético desmosómico DP y la pérdida de su actividad da como resultado un aumento en la DP total simple y doblemente fosforilada, así como la acumulación de DP hiperfosforilada concentrada en las uniones célula-célula. Además, demostramos que la fosforilación de DP inducida por la inhibición de PP2A-B55α debilita la adhesión intercelular, presumiblemente a través de una disminución en la fuerza de la conexión DP-IF. La importancia del motivo GSR DP C-terminal como objetivo para la regulación de PP2A-B55α está respaldada por el hecho de que el mutante DP S2849G protege contra la disminución observada en la adhesión debido al agotamiento genético de B55α o la subunidad catalítica PP2A. Anteriormente demostramos que las enzimas GSK3β y PRMT-1 cooperan para mediar la fosforilación de DP14. Junto con el trabajo actual, proponemos un mecanismo regulador actualizado mediante el cual PP2A-B55α y PRMT-1/GSK3β forman un interruptor molecular a través de la fosforregulación del extremo C de DP para ajustar la conexión DP-IF que controla el adhesivo celular. y resistencia a la tracción (Fig. 5).

Un equilibrio entre las actividades de PP2A-B55alfa y GSK3β/PRMT1 en el extremo C de DP controla la fuerza de adhesión del desmosoma mediante la regulación de la conexión DP-IF. Un esquema que representa el interruptor regulador que controla la adhesión mediada por desmosomas a través de la fosforregulación de la interacción DP-IF. Albrecht et al. Anteriormente se identificó que GSK3β y PRMT1 cooperan para inducir la fosforilación del extremo C de DP que inhibe la unión de DP-IF y debilita la adhesión desmosomal. Nuestro trabajo ha descubierto que PP2A-B55α es un nodo regulador opuesto capaz de desfosforilar el extremo C de DP, induciendo una mayor adhesión celular potencialmente a través de una mayor asociación entre DP e IF.

La actividad de PP2A-B55α se ha asociado con la regulación de varios procesos celulares, incluido el crecimiento celular, la replicación del ADN, la salida mitótica, la citocinesis y la integridad de los microtúbulos30,31. Sus sustratos mejor caracterizados incluyen la proteína tau de unión a tubulina, la proteína reguladora del huso PRC1, la proteína de bolsillo p107 y muchos de los sustratos del ciclo celular CDK1. Con la fuerte superposición de los sustratos de B55α y la regulación del ciclo celular, se ha pensado principalmente que PP2A-B55α es una enzima reguladora del ciclo celular. Nuestro trabajo presenta un papel potencial para el regulador del ciclo celular PP2A-B55α en queratinocitos diferenciados no replicantes que experimentan altos niveles de tensión intercelular que requieren un fuerte anclaje desmosoma-IF y ya no requieren altos niveles de regulación del ciclo celular.

Trabajos recientes en cardiomiocitos y epitelios simples revelaron que los desmosomas son estructuras mecanosensibles, que responden al estrés mecánico reclutando proteínas desmosomas en los sitios de adhesión célula-célula32,33. A pesar de estos informes, no está claro cómo el desmosoma puede afectar de manera diferencial la mecánica epidérmica en toda la epidermis estratificada. Un mecanismo potencial podría ser a través de sus conexiones citoesqueléticas. De acuerdo con esta idea, la interferencia con la interacción DP-IF inhibe la formación de uniones estrechas en modelos 3D, lo que respalda su importancia para la función de la barrera epidérmica34,35. Dada nuestra observación previa de que un hipofosfomímico de DP aumenta la rigidez de la lámina epitelial19, nuestros datos plantean la posibilidad de que ajustar las interacciones DP-IF a través de la desfosforilación mediada por PP2A-B55α podría contribuir al gradiente de rigidez que recientemente se informó que existe en la epidermis estratificada36. A su vez, el aumento de la tensión en la epidermis superficial ayudaría a mantener las uniones estrechas en el estrato granuloso superficial 2 (SG2). Esto es consistente con estudios previos que muestran que la actividad catalítica de PP2A y la subunidad reguladora B55α son específicamente necesarias para el desarrollo epidérmico normal, la función de barrera y específicamente la formación de uniones estrechas en modelos celulares e in vivo de pérdida de PP2A24,25,26,27. Además, la activación de PP2A mediante tratamientos tópicos con extractos de plantas mejoró la función de barrera epidérmica en seres humanos37. En conjunto, estos datos descubren un posible mecanismo para explicar cómo la holoenzima PP2A-B55α regula tanto la barrera epidérmica como la mecánica del tejido.

La importancia de la asociación DP-IF se destaca por las enfermedades cardiocutáneas graves asociadas con mutaciones en el dominio C-terminal de DP que interfieren con el sitio de unión de IF y el motivo fosforregulador9,13. Estas incluyen la enfermedad cardiocutánea síndrome de Carvajal, asociada con una mutación por truncamiento en el extremo C terminal de DP, y la enfermedad relacionada con el desmosoma AC10,38,39. AC se asocia con mutaciones en varios componentes del desmosoma, incluida una mutación puntual dentro del extremo C de DP que interfiere con la regulación adecuada del motivo fosforregulador que hemos identificado como objetivo de PP2A-B55α. Además, la expresión ectópica de un mutante DP constitutivamente hipofosforilado fue suficiente para restaurar la distribución de IF y preservar la adhesión célula-célula en un modelo de enfermedad por deficiencia de desmosomas de pénfigo vulgar40. En particular, sólo la mitad de todos los casos de CA se han relacionado con mutaciones en componentes conocidos del desmosoma39. La identificación de PP2A-B55α como regulador del fosfomotivo del extremo C terminal de DP plantea la posibilidad de que las mutaciones en el complejo PP2A-B55α puedan ser un candidato que impulse enfermedades desmosómicas en pacientes sin una mutación desmosómica identificada. Finalmente, un trabajo colaborativo publicado previamente que muestra que la inhibición de PP2A aumentó la fosforilación de una secuencia conservada en la Plectina, relativa a la familia de las plaquinas expresada de manera más ubicua, plantea la posibilidad de que B55α pueda desempeñar un papel regulador más amplio para las plaquinas en diferentes tipos de tejidos, incluidos el músculo cardíaco y esquelético41.

En resumen, hemos identificado PP2A-B55α como un componente recientemente reconocido de un interruptor molecular que también contiene PRMT-1/GSK3β. A través de su capacidad para regular negativamente un fosfomotivo crítico en el extremo C de DP, proponemos que PP2A-B55α sintonice la adhesión mediada por desmosomas para proporcionar a los desmosomas las propiedades dinámicas necesarias para el desarrollo y mantenimiento de la barrera epidérmica.

Se cultivaron células SCC9 de carcinoma oral de células escamosas de origen humano (un obsequio de J. Rheinwald, Escuela de Medicina de Harvard, Boston, MA) en DMEM/F12, FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Se cultivaron células HaCaT de queratinocitos humanos inmortalizados en DMEM, FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Las líneas celulares se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Los queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK) se aíslan del prepucio neonatal proporcionado por el Centro basado en recursos de enfermedades y biología de la piel (SBDRC) de la Universidad Northwestern, como se describió anteriormente 42. Los NHEK se mantuvieron en medio de crecimiento M154 (Thermo Fisher Scientific) suplementado con CaCl2 0,07 mM. , suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos (HKGS; Thermo Fisher Scientific), gentamicina y anfotericina B. Se utilizaron NHEK para generar cultivos organotípicos epidérmicos reconstruidos en 3D como se describió anteriormente 42.

Para la transfección de ARNip, las células se sembraron en placas y se cultivaron durante la noche hasta una confluencia del 60% antes de la transfección con Dharmafect (Thermo Fisher Scientific). Se utilizaron ARNip Dharmacon ON-TARGET (Horizon Discovery) para apuntar a PP2A-C (J-003598–09) y B55α (J-004824–06). Para los estudios de tratamiento farmacológico, las células se cultivaron en confluencia durante 3 días antes del tratamiento con OA (50 nM o 100 nM), tautomicina (250 nM) o DMSO durante 3 h. Se utilizó doxiciclina (Sigma Aldrich) en concentraciones de 1 μg/ml. Las NHEK se cultivaron hasta confluencia y se incubaron en un suplemento de medio de crecimiento con CaCl2 1,2 mM durante 2 días antes del tratamiento farmacológico.

Las células colocadas en cubreobjetos de vidrio se fijaron en metanol anhidro helado durante 3 minutos en hielo para visualizar la tinción con fosfo S2849 DP/DP total o en una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de metanol anhidro helado para 3 min en hielo para visualizar B55α. Las células se bloquearon con suero de cabra al 5% o con BSA al 1% y suero de burro al 1%. Todas las muestras se montaron en portaobjetos de vidrio con reactivo antidecoloración ProLong Gold (Thermo Fisher Scientific). Se tiñeron muestras de piel humana y de piel reconstruidas en 3D a partir de muestras incrustadas congeladas y se fijaron como se describe anteriormente. Para el análisis de PLA, las muestras se fijaron como se describe anteriormente y el PLA se realizó como se describe en Hegazy et. al29.

Las imágenes de Apotome se adquirieron utilizando el software ZEN 2.3 con un sistema de microscopio de epifluorescencia (Axio Imager Z2, Carl Zeiss) equipado con un sistema X-Cite 120 LED Boost, un módulo de diapositivas Apotome.2, una cámara digital Axiocam 503 Mono y un Plan-Apocromático. 40x/1.4, objetivo Plan-Apocromático 63x/1.4, objetivo Plan-Apocromático 100x/1.4 (Carl Zeiss). Las imágenes se procesan utilizando el software ImageJ. El análisis de colocalización se realizó utilizando el complemento JaCoP ImageJ28.

Los lisados ​​​​de células completas se generaron utilizando tampón de muestra de urea (urea 8 M, SDS al 1 %, Tris 60 mM, pH 6,8, b-mercaptoetanol al 5 %, glicerol al 10 %). Las proteínas se separaron mediante electroforesis SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Se utilizó leche al 5% para bloquear las membranas y diluir los anticuerpos primarios y secundarios. Las proteínas inmunorreactivas se visualizaron utilizando quimioluminiscencia o anticuerpos secundarios de fluorescencia LI-COR. Las imágenes de todas las transferencias sin recortar se incluyen en la figura complementaria 5.

La SDS-PAGE con afinidad por fosfato se realizó utilizando Phos-tag (Wako Pure Chemical Industries). El procedimiento se realizó siguiendo el protocolo del fabricante (http://www.phos-tag.com). Se añaden 50 µM de péptido de acrilamida phos-tag durante la preparación de un gel de poliacrilamida al 15% peso/vol. La electroforesis en gel se realizó a 15 mA durante 5,5 h y se transfirió durante la noche a una membrana de PVDF. La inmunotransferencia posterior se realizó como se describe anteriormente. La cuantificación de bandas se realizó utilizando el software Image Studio (LI-COR).

Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: NW6 Rabbit anti-DP C-terminal43; NW161 Conejo anti-DP N-Terminal44; 11-5F C-terminal anti-DP de ratón (Sigma, regalo de D. Garrod45); anti-fosfo-S2849 DP14,41; anti-dual fosfo-S2845 y S2849 DP generados contra un péptido sintético correspondiente a 2843-2853 de DP humano (21st Century Biochemicals)14; anti-Desmogleína 3 5G11 (Sigma-Aldrich); 1407 Anti-PG de pollo (Laboratorios Aves); Ratón 2G9 anti-B55α (Tecnología de Señalización Celular); PA5-18512 Anti-α-Catenina de cabra (Thermo Fisher Scientific); PA5-17443 Anti-α-Catenina de conejo (Thermo Fisher Scientific); anti-S-Tag de ratón (EMD Millipore); Anti-GAPDH de ratón (Santa Cruz Biotechnology); 12G10 Anti-α-tubulina de ratón (Banco de Estudios de Hibridoma del Desarrollo); JL-8 Ratón anti-GFP (Clontech). Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios: IgG HRP anti-ratón de cabra (Cell Signaling Technologies); IgG de cabra anti-conejo HRP (tecnología de señalización celular); Anti-Ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor-488 (Thermo Fisher Scientific); Anti-Ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor-568 (Thermo Fisher Scientific); Anti-Pollo de cabra conjugado con Alexa Fluor-647 (Thermo Fisher Scientific); Donkey anti-Goat conjugado con Alexa Fluor-488 (Thermo Fisher Scientific); Anti-Ratón Donkey conjugado con Alexa Fluor-568 (Thermo Fisher Scientific); Anti-Conejo de burro conjugado con Alexa Fluor-647 (Thermo Fisher Scientific).

Las células cultivadas en confluencia durante 3 días se lisaron en tampón NP40 (Tris-HCl 10 mM, pH 8, NaCl 100 mM, NP40 al 0,2%, glicerol al 10%, con tableta inhibidora de proteasa) en hielo durante 30 minutos. El sobrenadante se recogió mediante centrifugación y se incubó durante la noche a 4 ° C rotando con anticuerpo anti-DP o anticuerpo anti-B55α conjugado con agarosa (Sant Cruz Biotechnology). La proteína A/G conjugada con agarosa se giró durante 1 h a 4 °C antes de la centrifugación y se lavó en 1 x tampón NP40. Las muestras se resuspendieron en tampón Lamelli 3X y se hirvieron a 100 °C durante 10 minutos antes de realizar el análisis de transferencia Western.

Las monocapas celulares se cultivaron en confluencia durante 5 días por triplicado en placas de 12 pocillos. Las células se lavaron en PBS y se trataron con 2,4 U/ml de dispasa (Sigma Millipore) diluida en PBS que contenía Ca2+ durante 30 min. Las monocapas levantadas se colocaron en tubos cónicos de 15 ml que contenían 3 ml de PBS y se colocaron en una rejilla. La rejilla se invirtió de 5 a 10 veces como se describe en (Hudson et al.)46. Los fragmentos resultantes se devolvieron a placas de 12 pocillos y se tomaron imágenes usando un microscopio de disección (MZ6; Leica).

No se generaron ni analizaron grandes conjuntos de datos durante el estudio actual. Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios. Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio verde por sus valiosos comentarios y debates. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Centro Basado en Recursos de Enfermedades y Biología de la Piel de la Universidad Northwestern de los Institutos Nacionales de Salud con el número de premio P30AR075049. El trabajo de imágenes se realizó en el Centro de Microscopía Avanzada de la Universidad Northwestern, con el generoso apoyo del NCI CCSG P30 CA060553 otorgado al Centro Integral del Cáncer Robert H. Lurie. La Instalación Central de Patología (PCF) de la Universidad Northwestern y el Laboratorio de Histología y Fenotipado de Ratones (MHPL) realizaron la sección de muestras de piel humana y reconstruyeron equivalentes de piel en 3D. Este trabajo fue apoyado por NIH R01 AR43380, NIAMS R01 AR041836 y NCI R01 CA228196 de KJG. ALP fue compatible con T32AR060710 y F32AR081677.

Departamento de Patología, Facultad de Medicina Feinberg, Universidad Northwestern, 303 E Chicago Ave., Chicago, IL, 60611, EE. UU.

Abbey L. Perl, Jennifer L. Koetsier y Kathleen J. Green

Departamento de Dermatología, Facultad de Medicina Feinberg, Universidad Northwestern, Chicago, IL, EE. UU.

Kathleen J. Verde

Centro Oncológico Integral Robert H. Lurie, Universidad Northwestern, Chicago, IL, EE. UU.

Kathleen J. Verde

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Conceptualización ALP y KJG; metodología ALP y JLK; escribiendo ALP y KJG; visualización ALP; adquisición de financiación ALP y KJG

Correspondencia a Kathleen J. Green.

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Perl, AL, Koetsier, JL y Green, KJ PP2A-B55alfa controla la adhesión de queratinocitos mediante la desfosforilación del extremo C de la desmoplaquina. Informe científico 13, 12720 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37874-8

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Recibido: 07 de noviembre de 2022

Aceptado: 28 de junio de 2023

Publicado: 05 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37874-8

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