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Jun 20, 2023

Fusión de partículas de super.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 13327 (2023) Cite este artículo 1591 Accesos 2 Detalles de Altmetric Metrics La microscopía de localización de una sola molécula ofrece una resolución casi inferior a la

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13327 (2023) Citar este artículo

1591 Accesos

2 altmétrico

Detalles de métricas

La microscopía de localización de moléculas individuales ofrece una resolución casi hasta el nivel molecular con etiquetado molecular específico y, por lo tanto, es una herramienta prometedora para la biología estructural. En la práctica, sin embargo, el valor real de este campo está limitado principalmente por un etiquetado fluorescente incompleto de la estructura. Esta información faltante se puede completar fusionando información de muchas partículas estructuralmente idénticas en un enfoque de fusión de partículas similar al análisis crio-EM de una sola partícula. En este artículo, presentamos un análisis de datos de los resultados de la fusión de partículas de nucleoporinas Nup96 marcadas con fluorescencia en el Complejo de Poros Nucleares para mostrar que Nup96 ocurre en una disposición espacial de dos anillos de 8 unidades con dos copias de Nup96 por unidad, lo que da un total de 32 Nup96. copias por poro. Utilizamos el modelado asistido por inteligencia artificial en Alphafold para ampliar el modelo crio-EM existente de Nup96 para identificar con precisión las posiciones de las etiquetas fluorescentes y mostrar que la precisión de la coincidencia entre los datos fluorescentes y crio-EM es mejor que 3 nm en el plano. y 5 nm fuera del plano.

El Complejo de Poros Nucleares (NPC) es una máquina molecular esencial incrustada en la envoltura nuclear que conecta el núcleo con el citoplasma1,2,3. El NPC actúa como una barrera de difusión que separa el compartimento nuclear del citoplasma y funciona como puerta de entrada para la regulación genética4,5. Es indispensable en procesos celulares eucariotas como la regulación del transporte de proteínas y ribonucleoproteínas4,6,7. Se ha estudiado ampliamente la estructura y composición molecular del NPC, en particular del andamio. Estudios previos de microscopía electrónica criogénica (crio-EM) y tomografía crioelectrónica (crio-ET) han resuelto la estructura del andamio NPC a alta resolución1,2,3,8,9,10,11. El andamio está compuesto por múltiples copias de aproximadamente 34 nucleoporinas diferentes (Nups) y estas Nups están organizadas en tres anillos12,13,14. Estudios anteriores han demostrado que el anillo citoplasmático (CR) y el anillo nuclear (NR) están compuestos por múltiples complejos de los llamados Y y que las proteínas Nup96 están contenidas en estos complejos Y10,15. Cada anillo contiene 16 moléculas de Nup96, organizadas en unidades con simetría rotacional óctuple15,16,17.

La microscopía de superresolución está surgiendo como una técnica complementaria para el estudio de la estructura biológica, ya que proporciona una resolución de "difracción ilimitada"18,19,20. La microscopía de localización de molécula única (SMLM) es una de estas técnicas de súper resolución y obtiene imágenes súper resueltas con una resolución de 10 a 20 nm mediante la localización de emisores fluorescentes únicos18,21. Si se pueden obtener imágenes de muchas estructuras químicamente idénticas, llamadas partículas, se pueden registrar y combinar en una "superpartícula". Con esta estrategia, se puede mitigar el grado, a menudo deficiente, de etiquetado de cada partícula individual y se pueden obtener reconstrucciones con una resolución incluso mejor que la típica de 20 nm22,23,24,25. En SMLM se han aplicado diferentes métodos de fusión de partículas basados ​​en plantillas 2D para demostrar la simetría rotacional de ocho veces del NPC22,26,27. Sin embargo, estos métodos conllevan el riesgo de generar reconstrucciones con un sesgo hacia la plantilla. Más adelante, un enfoque de registro 2D sin plantillas podría revelar la simetría ocho veces mayor del NPC de manera imparcial28. Este método sin plantillas se extendió a 3D y se utilizó para reconstruir la estructura 3D de Nup107 y Nup96, revelando dos anillos desfasados ​​con ocho manchas por anillo29. Sin embargo, este enfoque 3D adolecía del artefacto del "punto caliente", que sólo podía mitigarse aplicando conocimientos previos sobre la simetría ocho veces mayor en un paso de posprocesamiento. En otro enfoque de fusión de partículas en 3D, se ajusta un modelo a los NPC individuales30 y las partículas se combinan en orden de similitud para formar la superpartícula. Este enfoque también muestra dos anillos con ocho manchas o grupos cada uno en la reconstrucción de NPC, como se esperaba, pero, curiosamente, algunas de las manchas están alargadas e inclinadas en el plano de los anillos. Limitados por su alto coste computacional, ni el método de Ref.29 ni el de 30 pueden reconstruir miles de partículas en un tiempo razonable. Recientemente introdujimos un enfoque de fusión de partículas rápida y sin plantilla31 que supera la limitación de la velocidad de cálculo, de modo que ahora se puede acceder a conjuntos de datos de varios miles de partículas (o más) para el análisis estructural. En nuestro enfoque iterativo de fusión rápida de partículas31, rotamos y trasladamos todas las partículas para que se ajusten a un modelo de mezclas gaussianas (GMM) utilizando el método de registro conjunto de nubes de puntos múltiples (JRMPC)32 y posteriormente actualizamos las posiciones y anchos de los centros gaussianos. En cada ronda de iteración se actualizan tanto las partículas como el GMM. Debido a las limitaciones inherentes del método de registro conjunto32, sólo podemos obtener una alineación óptima local de las partículas que constan de varios grupos distintos con diferentes poses. Luego clasificamos33 estas partículas alineadas con diferentes poses y las recombinamos para obtener una solución global óptima que consiste en una única estructura bien alineada.

Hasta ahora, SMLM del NPC pudo revelar la simetría rotacional de octavo grado, resolver ocho puntos individualmente por anillo y pudo mostrar la separación de los anillos nuclear y citoplasmático en 3D. Aunque a partir del trabajo crio-EM15 se sabe que, por ejemplo, los Nup96 se presentan como ocho unidades distintas por anillo, donde una sola unidad contiene dos copias de Nup96, esto hasta ahora no ha podido resolverse mediante SMLM convencional. Aquí mostramos que cada una de las ocho manchas contiene dos fluoróforos unidos mediante una etiqueta SNAP a la unidad Nup96 combinando nuestro método rápido de promediación de partículas sin plantilla31 con un análisis cuidadoso de datos en 5 conjuntos de datos (que se originan en cinco núcleos de cinco células) de un total 4538 NPC30. Hicimos una comparación detallada del resultado de nuestro análisis con los datos crio-EM. Con este fin, ampliamos el modelo incompleto de Nup96 derivado de von Appen et al.15 por Alphafold34 para encontrar las posiciones donde se espera que las etiquetas SNAP fluorescentes se adhieran al Nup96. A continuación, registramos nuestras posiciones estimadas de las unidades fluorescentes en estas posiciones esperadas de la etiqueta SNAP del modelo crio-EM y encontramos que la distancia promedio entre las posiciones SNAP derivadas del modelo crio-EM y de nuestro análisis de datos SMLM es < 3 nm lateralmente y 5 nm axialmente.

Hemos aplicado los pasos metodológicos descritos en la sección "Métodos" a cinco conjuntos de datos de Nup96. El conjunto de datos 1 se describió anteriormente30; Los conjuntos de datos 2 a 5 resultan de la misma línea celular y protocolo de tinción e imágenes. El número de NPC analizados por conjunto de datos es 368, 568, 706, 1178 y 1718 para un total de 4538 NPC. Dado que el método de fusión rápida de partículas31 utiliza GMM generado aleatoriamente y conduce a diferentes reconstrucciones para el mismo conjunto de datos, realizamos el proceso de fusión 10 veces para cada conjunto de datos (incluido el conjunto de datos combinado), lo que resultó en un total de 60 reconstrucciones. Luego realizamos análisis de datos cuidadosamente sobre estas reconstrucciones para obtener nuestros resultados.

En las figuras 1a a c) mostramos una de las reconstrucciones de superpartículas del conjunto de datos combinado que consta de 4538 NPC. En la vista superior del anillo nuclear (NR) y citoplasmático (CR) (a, b), el alargamiento de las manchas es claramente visible. La Figura 1d) muestra un histograma de las coordenadas z de la reconstrucción en las Fig. 1a-c). Las localizaciones de NR y CR son visibles en los dos picos con una distancia de 48,5 nm. La Figura 1e) muestra la distancia promedio entre los picos del histograma z NR y CR para los 5 conjuntos de datos individuales y el conjunto de datos combinado. Los diagramas de caja dan una indicación de la distribución estadística de los parámetros ajustados para las 10 reconstrucciones independientes que se realizaron para cada uno de los 6 conjuntos de datos. El bigote inferior de la trama se extiende hasta el valor mínimo de 46,6 nm, mientras que el bigote superior se extiende hasta el valor máximo de 49,1 nm. La mediana de los datos es de aproximadamente 48,1 nm. En las figuras 1e a g), los valores atípicos se indican con el símbolo de asterisco (*).

A continuación, analizamos la forma de las 16 manchas separadas en las reconstrucciones. Con ese fin, primero aplicamos una rutina para eliminar localizaciones atípicas (ver "Métodos"), reduciendo el número de localizaciones en un 32%. En la Fig. 1f), el valor mediano de la elipticidad es consistente y oscila entre 0,90 y 0,93 para todos los conjuntos de datos. Hay algunos valores atípicos que oscilan entre 0,75 y 0,85, que son inferiores a los valores medianos. Además, parece que los ejes largos de las elipses forman un ángulo mediano de alrededor de \(\pm 5.5^{\circ }\) con la tangente a los anillos, con un signo opuesto para CR y NR (Fig. 1g). . Si la elipticidad se debía a un error de registro o a un artefacto del procedimiento de fusión de partículas, entonces el eje longitudinal de las elipses estaría alineado con la tangente de los anillos. Por lo tanto, podemos concluir que la inclinación distinta de cero de las manchas elípticas es evidencia de una característica estructural. La explicación más simple es que cada mancha elíptica es la combinación de eventos de localización de emisores que se unen a dos sitios de unión distintos, es decir, la fusión de partículas sugiere directamente que Nup96 ocurre en una disposición con dos copias de Nup96 por unidad. Observamos que la evidencia de (al menos) dos sitios de unión proviene de la interpretación de la característica estructural de la elipticidad. Los sitios de unión no pueden observarse directamente como dos puntos distintos en las reconstrucciones. Es notable que los blobs en NR tienen una mejor relación señal-ruido (SNR) que los blobs en CR (Fig. 1c) y el NR tiene un número significativamente mayor de localizaciones en comparación con el CR, con alrededor de 22 % más localizaciones (Fig. 1d). Esta diferencia de calidad puede deberse a la forma en que el método JRMPC fusiona los datos. En una optimización global, se puede lograr un mejor registro para una parte de la estructura (aquí NR) a expensas de la calidad del registro de otra parte de la estructura (aquí CR). Además, la heterogeneidad estructural también podría contribuir a las diferencias observadas en la calidad del registro.

(a – c) Una de las reconstrucciones 3D de Nup96 a partir de 4538 partículas NPC del conjunto de datos combinado. La reconstrucción de salida incluye todas las partículas de entrada. La reconstrucción resuelve dos anillos y 8 manchas por anillo. (a) vista superior del anillo nuclear (NR), (b) vista superior del anillo citoplasmático (CR), (c) vista lateral, (d) histograma de las coordenadas z de localizaciones en la reconstrucción obtenida del conjunto de datos combinado, y ajuste gaussiano bimodal a los datos. La distancia entre los dos picos del histograma es 48,5 ± 0,1 nm. (e) Distancia entre NR y CR para todos los conjuntos de datos. (f) Elipticidad promedio e de las manchas elípticas para NR (azul) y CR (rojo), (g) ángulo promedio \(\phi \) del eje largo de las manchas elípticas con la tangente al anillo en xy -plano para NR (azul) y CR (rojo) (los ángulos negativos indican rotación en el sentido de las agujas del reloj). La barra de escala en (a) es de 40 nm y también se aplica a (b,c).

Investigamos dos enfoques para estimar las posiciones de los dos sitios de unión en las unidades Nup96. En primer lugar, utilizamos un ajuste sin restricciones de 16 centros gaussianos anisotrópicos para NR y CR por separado, y en segundo lugar utilizamos un ajuste restringido en el que imponemos la simetría rotacional de ocho veces [de acuerdo con las Ecs. (1) y (2)].

Ubicaciones de los sitios de unión obtenidas de un ajuste sin restricciones (púrpura) y de un ajuste restringido con simetría de ocho veces (rosa). Estos ajustes se obtienen a partir de la reconstrucción que se muestra en las figuras 1a a c) del conjunto de datos combinado. Vista superior de los sitios de unión para NR (a) y CR (b). (c) Vista oblicua de CR y NR para proyección en un ángulo \(15^\circ \) con el plano xy. La barra de escala en (a) también se aplica a (b,c).

Encontramos que la distancia entre los 16 sitios de unión de los dos enfoques de ajuste para los datos combinados es \(2.8\pm 1.7\) nm para NR y \(3.6\pm 1.4\) nm para CR (ver Fig. 2). ). Esta pequeña diferencia indica que nuestros datos coinciden bien con la simetría de ocho veces y que el uso de la restricción de simetría en el ajuste es un procedimiento válido.

La Figura 3 muestra los parámetros estructurales (radio R de CR y NR, distancia d entre los dos sitios de unión en la unidad, ángulo de inclinación fuera del plano \(\theta \) de la unidad, ángulo de inclinación en el plano \(\ phi \) de la unidad) para todos los conjuntos de datos para el caso de ajuste restringido por simetría. A modo de comparación, también mostramos los valores de referencia de los datos crio-EM (\(R=54\) nm, \(d=11.8\) nm, \(\phi =-32.6^{\circ }\) (NR) , \(\phi =32.1^{\circ }\) (CR), \(\theta =76.8^{\circ }\))15,34. Los parámetros estructurales obtenidos del ajuste restringido por simetría son relativamente consistentes entre las diferentes reconstrucciones y cercanos a los valores de referencia crio-EM. En particular, el radio y la distancia entre los sitios de unión en la unidad coinciden bien, donde los ángulos están un poco más desviados en comparación con el modelo crio-EM. Existen algunas variaciones entre los conjuntos de datos, donde los conjuntos de datos 3 y 4 parecen tener localizaciones más dispersas que los demás, lo que resulta en reconstrucciones visualmente más pobres para NR y CR. Las incertidumbres estimadas de los parámetros para NR son menores que para CR, lo que es consistente con la menor calidad de reconstrucción de CR en comparación con NR. El radio del NR coincide muy bien con el valor de referencia crio-EM, mientras que el radio del CR es consistentemente aproximadamente 2,5 nm más pequeño. La estimación de la distancia entre los sitios de unión en la unidad es algo menor que la distancia de referencia crio-EM. Encontramos que el ángulo de inclinación en el plano tiene el signo opuesto para NR y CR, lo que es consistente con el modelo crio-EM. La magnitud estimada del ángulo de inclinación en el plano es algo menor que los valores de referencia crio-EM. Se encuentra una discrepancia cuantitativa mayor para el ángulo de inclinación fuera del plano, que atribuimos a la incertidumbre de localización en la dirección axial, que es de dos a tres veces mayor que la incertidumbre en el plano xy35.

Los parámetros estructurales para el ajuste restringido de simetría ocho veces mayor para NR (azul) y CR (rojo) para todos los conjuntos de datos. Los parámetros de las ubicaciones de los fluoróforos derivados del modelo crio-EM se muestran como líneas discontinuas y los valores atípicos identificados en los resultados de SMLM se indican con el símbolo de asterisco (*). (a) Radio para NR y CR, el radio NR es de alrededor de 54,1 nm y el radio de CR es de alrededor de 51,6 nm. El radio de referencia es 54,2 nm. (b) Distancia entre los sitios de unión en las unidades. La distancia en unidades es \(9,7\pm 2,2\) nm y el valor de referencia es 11,8 nm. (c) Ángulo fuera del plano \(\theta \) de la línea que conecta los dos emisores en una unidad con el eje z, \(\theta = 79.1^\circ \pm 7.3^\circ \) y el El valor de referencia es \(\theta =76,8^\circ \). (d) Ángulo en el plano \(\phi \) de la línea que conecta los dos emisores en la unidad con la tangente del anillo en el plano xy, \(\phi \sim -12.8\pm 7.0^\circ \ ) para el NR y \(\phi \sim +13.7\pm 7.5^\circ \) para el CR. El ángulo de referencia es \(-32.6^\circ \) para NR (línea discontinua azul) y \(32.1^\circ \) para CR (línea discontinua roja). Para los paneles (c,d), los ángulos positivos indican rotación en sentido antihorario.

La Figura 4 muestra una comparación directa entre las posiciones de las etiquetas SNAP predichas a partir de los datos crio-EM y las posiciones de los emisores según los datos de fusión de partículas SMLM. Los emisores de SMLM se generan a partir de los parámetros de ajuste restringidos de simetría generales obtenidos al promediar los 60 ajustes. Medimos la distancia entre los emisores correspondientes de nuestro ajuste restringido de simetría y las etiquetas SNAP predichas a partir del crio-EM. Para el NR encontramos distancias en el plano de 2,1 nm y 2,3 nm, y distancias fuera del plano de 5,1 nm y 5,0 nm para las dos posiciones de emisor en la unidad, para el CR encontramos distancias en el plano de 4,2 nm y 0,4 nm, y distancias fuera del plano de − 3,5 nm y − 5,2 nm para las dos posiciones de emisor en la unidad. Tenga en cuenta que no podemos asignar la posición del fluoróforo directamente en nuestro modelo estructural, que se limita a modelar la posición de la etiqueta SNAP en relación con NUP96, mientras que medimos la posición del fluoróforo directamente en SMLM. La distancia esperada entre la etiqueta SNAP y la posición del fluoróforo es de 1 a 2 nm. En general, la concordancia en el plano de los anillos NPC es bastante buena, con un error general de sólo \(2,2\pm 1,4\) nm.

El error lateral también parece estar libre de un sesgo sistemático entre las estimaciones de posición basadas en crio-EM y basadas en la fusión de partículas SMLM. Esto contrasta con las estimaciones de posición axial donde encontramos una distancia entre los emisores superiores en CR y NR de 48,4 nm, y entre los emisores inferiores en CR y NR de 47,3 nm. Parece que los datos SMLM dan una distancia entre NR y CR que es sistemáticamente menor que la distancia obtenida del modelo crio-EM, con un sesgo promedio en el espesor estimado de NPC obtenido de la comparación crio-EM/SMLM de 9,4 nm. La Figura 1e) muestra la distancia estimada entre NR y CR para todos los conjuntos de datos, así como la Figura 1d) muestra el histograma de las coordenadas z de las 244,946 localizaciones en la reconstrucción obtenida del conjunto de datos combinado. Encontramos que la distancia entre NR y CR en SMLM es \(48.0\pm 0.4\) nm, mientras que la distancia entre los anillos en el modelo EM es \(57.2\pm 0.2\) nm, un sesgo de aproximadamente 9.2 nm . Este análisis de los datos de localización axial subyacentes sugiere que el sesgo encontrado no se debe a un artefacto del método de fusión de partículas.

Superposición de las posiciones de los fluoróforos de los datos de fusión de partículas SMLM (rosa) y la etiqueta SNAP derivada de los datos crio-EM (púrpura). Para nuestros emisores SMLM generales (rosa), la distancia lateral entre una unidad es de 9,1 nm para NR y 10,0 nm para CR. Las distancias axiales entre una unidad son 2,4 nm para NR y 1,2 nm para CR. Las etiquetas SNAP (moradas) tienen distancias laterales entre unidades de 11,6 nm para NR y 11,5 nm para CR, así como distancias axiales de 2,5 nm para NR y 2,9 nm para CR.

En general, nuestro análisis de la fusión de partículas SMLM apunta a una estructura de unidad Nup96 que coincide bien con los datos crio-EM. Sin embargo, en comparación con el modelo crio-EM, persiste una inconsistencia importante. Es decir, se estima que la altura del NPC a partir de la fusión de partículas SMLM es aproximadamente 9 nm menor que la de crio-EM. En otros estudios SMLM se han informado valores de separación de anillos similares para Nup9636,37, y tienen una desviación mayor del modelo crio-EM que los niveles de error estadístico. Hay una serie de factores que podrían contribuir a esta discrepancia. En primer lugar, las diferencias en las líneas celulares y el estado funcional de las células pueden influir, ya que previamente se han observado discrepancias en la altura de los NPC en estructuras crio-ET de diferentes líneas celulares, con una altura \(\sim \) de 5 nm. diferencia observada entre NPC in situ observados en células HeLa y HEK. Estas diferencias podrían corresponder a distintos estados funcionales que implican, por ejemplo, dilatación del anillo interior3,9. En segundo lugar, los datos de localización axial se calibran en función de imágenes de referencia de NPC que están orientadas lateralmente. En una vista lateral, los dos anillos están claramente separados en el plano de la imagen. Allí la precisión de la localización es mucho mejor (\(2-3\times \)) que en la dirección axial y la separación se puede estimar fácilmente y utilizar para calibrar la coordenada axial37. Las vistas laterales se obtienen de los NPC en los lados del núcleo, mientras que los otros NPC están ubicados en la envoltura nuclear que se encuentra plana contra el cubreobjetos. En tercer lugar, si el movimiento del fluoróforo se restringe (parcialmente) durante la obtención de imágenes, los efectos de la orientación dipolar en las imágenes de una sola molécula pueden tener un impacto en la estimación de la posición lateral, lo que resulta en sesgos del orden de \(\sim \) 10 nm38. Un factor de confusión es el análisis de los datos SMLM 3D de Nup107, que es adyacente a Nup96 en el andamio NPC, y que se encontró que tenía una separación de anillo de 60 nm en la fusión de partículas SMLM29, de acuerdo con los datos crio-EM. Vale la pena mencionar que las partículas Nup107 se obtuvieron de otro experimento en el que la línea celular y el estado funcional de la célula eran diferentes de los conjuntos de datos analizados en este artículo.

Los parámetros estructurales estimados para NR parecen ser más consistentes entre conjuntos de datos que para CR (ver Fig. 3). Lo atribuimos al hecho de que las localizaciones de la CR están más dispersas y, a su vez, la superpartícula reconstruida allí es de menor calidad. La razón subyacente podría ser que la fusión de partículas tridimensionales favorece la alineación de un anillo, lo que deja el otro anillo más borroso, en particular en la dirección axial. Un posible punto de mejora podría ser volver a registrar las localizaciones en la CR mediante nuestro método de fusión de partículas por separado, lo que al final puede dar lugar a una reconstrucción de la CR con mejor calidad.

También se pueden prever otras mejoras técnicas en el análisis de datos. En primer lugar, la eliminación de localizaciones atípicas ahora se realiza mediante una cascada que consiste en agregar un centro gaussiano adicional al GMM y posteriormente filtrar las localizaciones según la densidad de localizaciones. Un único enfoque integrado puede mejorar la solidez del procedimiento de análisis de datos. En segundo lugar, la configuración inicial de los parámetros podría dar como resultado una mejor convergencia hacia los óptimos globales del ajuste de GMM. Un refinamiento más importante del análisis actual se relaciona con la selección del modelo. El análisis actual se basa en el modelo más simple que puede explicar las observaciones, es decir, que el Nup96 aparece en una estructura unitaria de dos copias. Por tanto, una posible mejora puede encontrarse en un criterio estadístico que respalde que hay 32 emisores en el NPC, frente a otro múltiplo de 16.

Recientemente, Helmerich et al.39 especularon que los fluoróforos a distancias inferiores a aproximadamente 10 nm no pueden resolverse de manera confiable con SMLM, aunque la precisión proporcionada por el microscopio, el proceso de análisis de datos y el recuento de fotones de una sola molécula observada deberían permitir tal distinción. Se supone que la transferencia de energía entre los fluoróforos cercanos provoca la reexcitación de los emisores al comienzo del experimento seguida del blanqueamiento de ambos, impidiendo la observación de ellos individualmente como se requiere para SMLM. En particular, con la introducción de MINFLUX y técnicas relacionadas36,40,41,42 que ofrecen precisión de localización nanométrica con un recuento bajo de fotones, estas observaciones podrían frustrar la obtención de imágenes directas de la separación de unidades en el NPC, excepto en casos raros, y dejar un análisis de datos cuidadoso como se presenta aquí. como única herramienta restante43. Gwosch et al.44 fusionaron 162 partículas NPC obtenidas a partir de los datos MINFLUX de 36 mediante el método de fusión de partículas totales29. Su resultado no representa la estructura unitaria que demostramos aquí. Esto puede deberse a varios factores, como la baja densidad de etiquetado o pocas localizaciones por partícula.

Muy recientemente, un nuevo método de códigos de barras de ADN, "Mejora de la resolución mediante imágenes secuenciales" (RESI), ha mejorado significativamente la precisión de la localización45. Al aplicar el método de promedio basado en datos30 para obtener una fusión de 1217 partículas, se pudieron distinguir proteínas Nup96 individuales dentro de una unidad. La distancia lateral y axial fue de 11,9 ± 1,2 nm y 5,4 ± 0,4 nm, respectivamente. Estos valores son algo mayores que los valores obtenidos de nuestro ajuste restringido de simetría en la Fig. 4. Medimos el ángulo de inclinación del eje largo y la elipticidad de cada gota en la Fig. 2g del artículo RESI. Encontramos para CR que el ángulo de inclinación es \(-9.3 \pm 3.1^{\circ }\), mientras que para NR el ángulo de inclinación es \(5.9 \pm 1.6^{\circ }\). En comparación, la figura 1g muestra ángulos de inclinación medianos de ± 5,5\(^{\circ }\) para las manchas CR y NR con signo opuesto. La aparente diferencia en la orientación de la estructura, es decir, el signo del ángulo de inclinación en el plano, de los resultados de RESI en comparación con nuestros resultados y los de la Ref.30 se debe a una diferencia en la proyección (vista desde el lado CR versus vista desde el lado CR). desde el lado NR). La elipticidad promedio de las manchas CR y NR en el resultado RESI es 0,86 ± 0,02 y 0,88 ± 0,03, respectivamente. En la figura 1f, encontramos que la elipticidad varía de 0,90 a 0,93 para las manchas CR y NR, respectivamente, en buena concordancia. En general, las conclusiones sobre la estructura de la unidad son similares; las diferencias pueden atribuirse a variaciones biológicas y diferencias en las condiciones de imagen.

En conclusión, hemos demostrado que SMLM puede revelar estructuras 3D en el rango de pequeños nanómetros. Nuestras reconstrucciones de fusión de partículas de alta resolución y el posterior análisis de datos permitieron la estimación precisa de las posiciones de 32 sitios de unión de emisores para Nup96 en el NPC. La comparación con los datos crio-EM muestra una consistencia mejor que 2,5 nm lateralmente, pero también un sesgo en la estimación de la altura del NPC de aproximadamente 9,2 nm. Esta última inconsistencia no se comprende bien y requiere más estudios por parte de la comunidad investigadora.

Aplicamos nuestro método de promedio de partículas publicado anteriormente31 a cinco conjuntos de datos SMLM de NPC individualmente y a los 5 combinados (un total de 4538 NPC). El conjunto de datos 1 con 368 NPC se describió previamente30 y los otros conjuntos de datos se obtuvieron en las mismas condiciones experimentales. Cada conjunto de datos corresponde a una sola celda. Nuestro método de fusión rápida de partículas primero alinea conjuntamente las partículas de entrada con un modelo de mezcla gaussiana (GMM) generado aleatoriamente. El número de componentes gaussianos y la desviación estándar gaussiana inicial del GMM están preestablecidos para una mejor convergencia en el paso de optimización iterativa32. Dado que el registro conjunto puede quedar atrapado en un óptimo local, que contiene varios grupos de partículas (clusters) con diferentes poses superpuestas en la reconstrucción, aplicamos un método de clasificación no supervisado33 para separar estos clusters y reconectar el cluster a la misma pose. Usamos los valores predeterminados dados en 31 para el algoritmo de fusión de datos, excepto el número de componentes gaussianos K en el modelo de mezcla gaussiana (GMM) y la desviación estándar gaussiana inicial de los componentes gaussianos. Establecemos \(K=34\), es decir, 32 componentes gaussianos para 32 sitios de unión y 2 para acomodar localizaciones falsas positivas del anillo nuclear y el anillo citoplasmático. Las posiciones iniciales de las partículas NPC (eje largo del cilindro) están aproximadamente alineadas con el eje óptico, ya que la membrana nuclear corre a lo largo del cubreobjetos. Podemos usar esto para establecer una desviación estándar gaussiana inicial en 33 nm, más pequeña que el tamaño total del NPC, para hacer que el algoritmo converja más rápido. Realizamos un promedio de partículas 10 veces en cada conjunto de datos y así obtuvimos un total de 60 superpartículas para incorporar la variabilidad estadística inducida por el GMM generado aleatoriamente en el análisis. Todas las superpartículas, que se muestran en el Apéndice, exhiben consistentemente dos anillos, cada uno de los cuales contiene 8 manchas de forma elíptica en los 5 conjuntos de datos, así como en el conjunto de datos combinado.

Obtenemos superpartículas a partir del promedio de partículas de diferentes conjuntos de datos que tienen la misma forma pero diferentes poses absolutas en el espacio 3D. Para una mejor comparación y un análisis más sencillo, alineamos su pose global de manera que los anillos sean perpendiculares al eje z de nuestro sistema de coordenadas global. Lo hacemos registrando las superpartículas en una plantilla fija que tiene dos anillos y cada anillo contiene ocho puntos con simetría rotacional ocho veces mayor. El centro de la plantilla se encuentra en el origen del sistema de coordenadas. La distancia entre los dos anillos de la plantilla es de 50 nm y el radio de cada anillo es de 55 nm. Finalmente, rotamos las superpartículas alrededor de los ejes x e y desde \(-3^\circ \) hasta \(3^\circ \) en pasos de \(0.2^\circ \) para encontrar el mínimo completo. ancho en la mitad del máximo (FWMH) del histograma de coordenadas z. Luego, dividimos la superpartícula en dos anillos de 8 burbujas según sus coordenadas z para su posterior análisis. Estos anillos representan el anillo nuclear (NR) y citoplasmático (CR) del NPC.

A continuación, eliminamos las localizaciones atípicas en cada anillo. Para este fin, usamos todas las localizaciones en un anillo y ajustamos un GMM inicializado aleatoriamente con 9 componentes gaussianos usando nuevamente el método JRMPC. En el plano xy, todos los centros GMM se generan aleatoriamente dentro de una caja 2D con un diámetro de 100 nm. Las coordenadas z de estos centros gaussianos iniciales se establecen en 0. Las desviaciones estándar de los componentes gaussianos iniciales se establecen en 33 nm. Por lo tanto, un GMM inicial con todos los componentes gaussianos ubicados cerca de las localizaciones y con desviaciones estándar comparables al tamaño del anillo es adecuado para que JRMPC converja. En todos los casos encontramos que hay 8 componentes con desviaciones estándar similares (pequeñas) y un componente con una desviación estándar grande, lo que indica el componente atípico. Eliminamos las localizaciones del último componente de los datos (esto es aproximadamente el 5% del número de localizaciones). Como el análisis de datos automatizado es sensible a las localizaciones atípicas, aplicamos un filtrado de valores atípicos adicional según la densidad de las localizaciones de los blobs. Eliminamos todas las localizaciones con una densidad local menor que un umbral de modo que cada mancha esté claramente separada de sus manchas adyacentes en la reconstrucción. Experimentamos con varios umbrales de densidad y determinamos que un valor del 95% de la densidad media de una sola mancha es adecuado para todas las reconstrucciones. Esta última operación elimina aproximadamente 1/3 de las localizaciones.

Los ejes largos de las manchas de forma elíptica en un anillo están inclinados con respecto a la circunferencia del anillo. Para investigar esto más a fondo, medimos la elipticidad de cada gota proyectada en el plano xy. La elipticidad se define como \(e=b/a\), donde a y b son las longitudes del eje largo y corto, respectivamente. También medimos el ángulo de inclinación entre el eje largo de cada gota y la tangente al anillo 2D general. Luego calculamos la distribución de la elipticidad y el ángulo de inclinación sobre el conjunto de valores para las 8 manchas de las 10 reconstrucciones en cada anillo.

La inclinación de la forma elíptica de las burbujas con respecto a los anillos indica que hay más de un emisor por burbuja. Como además el ángulo de inclinación también tiene signos opuestos en NR y CR, la inclinación no es un artefacto de reconstrucción. Sin embargo, la unidad de dos Nup96 no se puede resolver debido a la precisión de localización limitada, la deriva residual o el error de registro. Suponemos que hay dos emisores SNAP por blob según el conocimiento previo del modelo crio-EM de que hay dos copias de Nup96 por blob. Nuevamente utilizamos un GMM con 16 componentes para ajustar los 8 blobs por anillo e interpretar los centros de los componentes gaussianos como las posiciones de los emisores. Para el procedimiento de ajuste utilizamos la siguiente heurística: La desviación estándar inicial para el ajuste gaussiano es igual en las direcciones x e y (en el plano), pero dos veces mayor en la dirección z (que está alineada con el eje óptico). , porque la incertidumbre de localización axial suele ser dos o tres veces mayor que en el plano xy35. Además, suponemos que todas las unidades Nup96 en un anillo son idénticas, es decir, los componentes gaussianos en el GMM tienen matrices de covarianza diagonales idénticas.

Utilizamos Maximización de Expectativas (EM) iterativa para encontrar el GMM óptimo maximizando la probabilidad de que el GMM se ajuste a las localizaciones46. Las matrices de covarianza diagonal compartidas, los centros de los componentes gaussianos y las probabilidades posteriores de las membresías de los componentes son los parámetros de ajuste y se actualizan iterativamente. Los centros gaussianos obtenidos al ajustar el modelo de 16 mezclas gaussianas anisotrópicas están representados por \(G=\{\textbf{g}_i\}_{i=1}^{16}\) con \({\textbf{g}_i }=(g_{ix},g_{iy}, g_{iz})\).

Hemos empleado un segundo método de ajuste para hacer uso de la simetría de ocho veces, ya que el ajuste GMM anisotrópico sin restricciones es sensible a la configuración de los centros gaussianos iniciales. Con este fin, generamos 16 puntos con simetría óctuple como centros iniciales del ajuste anisotrópico GMM para cada anillo (ver Fig. 5). Los 16 sitios de unión definidos por el conjunto de puntos \(S=\{\{\textbf{s}_{kj}\}_{j=1}^{2}\}_{k=1}^{8} \) se caracterizan por 6 parámetros: (\(c_{1x}\), \(c_{1y}\), \(c_{1z}\), d, \(\theta \), \(\phi \ )), donde \({\textbf{c}_1}=\left( c_{1x}, c_{1y}, c_{1z}\right) \) es el centro del primero (\(k=1\ )) unidad, d es la distancia entre los dos sitios de unión en la unidad, \(\theta \) es el ángulo entre la línea que conecta los dos sitios de unión en una unidad y el eje z positivo (\(0\le \ theta \le \pi \)), y \(\phi \) es el ángulo entre la proyección de esta línea en el plano xy a la tangente del anillo en el plano xy (\(0\le \phi \le 2\pi\)). Las coordenadas en el plano del centro de la unidad se pueden parametrizar como \({\textbf{c}_1}=\left( c_{1x}, c_{1y}\right) =R\left( \cos \psi ,\ sin \psi \right) \), con R el radio del anillo y \(\psi \) el ángulo en el plano. Las coordenadas de los dos sitios de unión en la primera unidad vienen dadas por:

Elegimos que el emisor 1 sea el emisor que se encuentra por encima del plano central del anillo, es decir, restringimos el ángulo polar a \(0\le \theta \le \pi /2\). Las coordenadas de los sitios de unión de las otras unidades \(k=2,\dots ,8\) se pueden derivar girando estos puntos \((k-1)\pi /4\) en el plano xy. Los parámetros para los centros GMM iniciales son (0, 53,5 nm, ± 24 nm, 13 nm, \(\pi /2, \pi /4\)), donde \(+\) corresponde a NR y − a CR. El ángulo en el plano \(\phi \) se genera aleatoriamente en el intervalo de 0 a \(\pi \). Encontramos los parámetros de los conjuntos de puntos restringidos de simetría S a partir de las coordenadas del conjunto de puntos no restringido G minimizando el error cuadrático medio entre los conjuntos de puntos S y G con el método cuasi-Newton47 implementado en MATLAB.

Esquema de los parámetros estructurales de los 8 pares de dos sitios de unión con simetría general de ocho veces. El punto rojo es el centro del primer par y los puntos azules son los sitios de unión de las unidades.

Para relacionar las posiciones de los emisores encontradas con los datos estructurales disponibles en el NPC15 humano, modelamos la estructura completa de Nup96 usando Alphafold234 y agregamos la etiqueta SNAP en la posición carboxilo terminal de los Nup96. Instalamos el cuerpo rígido del Nup96 de longitud completa en la densidad crio-EM utilizando los residuos 881-1817 de PDB ID 5a9q como residuos de anclaje15. Como era de esperar, la etiqueta SNAP sobresale del conjunto del NPC, añadiendo soporte para su correcta colocación. Luego expandimos simétricamente el modelo ajustado para generar el conjunto NPC completo y denotamos el centro de masa del O\(^{6}\)-bencilguanina-AF647 (BG-AF647) para representar la posición del emisor.

Para alinear los modelos crio-EM y SMLM, primero medimos los parámetros de las etiquetas SNAP del modelo crio-EM. Luego, regeneramos las etiquetas SNAP en el modelo EM y las posiciones generales de emisor simétrico ocho veces en las reconstrucciones SMLM a partir de sus parámetros de ajuste individualmente, asegurando que compartan el mismo centro que la primera unidad. Las posiciones de las etiquetas SNAP predichas basadas en el modelo crio-EM están representadas por vectores de posición \({\textbf{m}_{kj}}=(m_{kj,x},m_{kj,y}, m_{kj, z})\) para \(k=1,\ldots 8\) y \(j=1,2\). Usando este conjunto de valores de referencia de vectores de posición para el radio R de CR y NR, la distancia d entre los dos sitios de unión en la unidad, el ángulo de inclinación en el plano \(\phi \) de la unidad y el ángulo exterior El ángulo de inclinación del plano \(\theta \) de la unidad se puede obtener a partir de ecuaciones similares a las ecuaciones. (1) y (2).

Los dos modelos se pueden comparar directamente calculando la distancia en el plano y axial de las posiciones de la etiqueta SNAP crio-EM a las posiciones estimadas del emisor a partir de la fusión de partículas SMLM:

Como los datos crio-EM satisfacen la simetría rotacional de ocho veces por construcción, solo comparamos las posiciones de las etiquetas SNAP crio-EM con las posiciones estimadas de los emisores de la fusión de partículas SMLM que se obtienen a partir de los ajustes de unidades restringidas por simetría. Eso significa que solo hay cuatro valores distintos para \(b_{xy,jk}\) y cuatro valores distintos para \(b_{z,jk}\) (CR y NR, dos posiciones de emisor por unidad).

El conjunto de datos y los códigos fuente de este trabajo están disponibles públicamente en https://github.com/wexw/Particle-fusion-Nup96.git.

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Este trabajo ha sido apoyado por el Consejo Holandés de Investigación (NWO), VICI Grant no. 17046 para BR y WW

Estos autores contribuyeron igualmente: Sjoerd Stallinga y Bernd Rieger.

Facultad de Ciencias Aplicadas, Universidad Tecnológica de Delft, Delft, Países Bajos

Wenxiu Wang, Arjen Jakobi, Sjoerd Stallinga y Bernd Rieger

Unidad de Biología Celular y Biofísica, Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL), Heidelberg, Alemania

Yu-Le Wu

Departamento de Biología Cromosómica, Universidad de Viena, Laboratorios Max-Perutz, Centro de Biología Molecular, Viena, Austria

Jonas Ries

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WW realizó análisis numéricos y ajustes de modelos. AJ proporcionó el análisis de los datos crio-EM. JR y YW adquirieron los datos SMLM de Nup96-SNAP. SS y BR supervisaron el estudio. Todos los autores contribuyeron a la redacción del artículo.

Correspondencia a Sjoerd Stallinga o Bernd Rieger.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Wang, W., Jakobi, A., Wu, YL. et al. La fusión de partículas de datos de superresolución revela la estructura unitaria de Nup96 en Nuclear Pore Complex. Informe científico 13, 13327 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39829-5

Descargar cita

Recibido: 25 de abril de 2023

Aceptado: 31 de julio de 2023

Publicado: 16 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39829-5

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