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Sep 14, 2023

Identificación y localización de proteínas del tubo polar en el tubo polar extruido del microsporidio Anncaliia algerae.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8773 (2023) Citar este artículo 311 Accesos Detalles de métricas Los microsporidios son parásitos intracelulares obligados capaces de infectar una amplia gama de huéspedes desde

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 8773 (2023) Citar este artículo

311 Accesos

Detalles de métricas

Los microsporidios son parásitos intracelulares obligados capaces de infectar una amplia gama de huéspedes, desde invertebrados hasta vertebrados. El éxito de su proceso de invasión se basa en un orgánulo original, el tubo polar, que repentinamente sale de la espora para inocular el esporoplasma en el citoplasma del huésped. El tubo polar está compuesto principalmente por proteínas denominadas proteínas del tubo polar (PTP). Un análisis comparativo nos permitió identificar genes que codifican 5 PTP (PTP1 a PTP5) en el genoma del microsporidio Anncaliia algerae. Mientras que PTP1 y PTP2 se encuentran en todo el tubo polar, PTP3 está presente en una gran parte del tubo polar extruido, excepto en su parte terminal. Por el contrario, PTP4 se detecta específicamente en la parte terminal del tubo polar. Para completar el repertorio de PTP, se realizaron extracciones secuenciales de proteínas esporales con alta concentración de agentes reductores. Además, se desarrolló un método para purificar tubos polares. El análisis de espectrometría de masas realizado en ambas muestras condujo a la identificación de una proteína similar a PTP3 (PTP3b) y una nueva PTP (PTP7) que solo se encuentra en el extremo del tubo polar. La localización específica de las PTP plantea la cuestión de su papel en los procesos de invasión celular utilizados por A. algerae.

Los microsporidios son parásitos intracelulares obligados relacionados con los hongos. Hay alrededor de 220 géneros y 1700 especies que pueden infectar a una amplia gama de huéspedes, desde insectos hasta mamíferos, incluidos los humanos1. El interés por los microsporidios ha aumentado en las últimas décadas debido a su implicación en trastornos humanos predominantemente en pacientes inmunocomprometidos, incluidas personas con VIH y personas que toman medicamentos inmunosupresores2,3. Sin embargo, los microsporidios no sólo se consideran patógenos oportunistas sino que también pueden ser causa de infecciones en huéspedes inmunocompetentes4,5. Varias especies pueden infectar a los humanos, incluida Anncaliia (sin. Nosema, Brachiola) algerae identificada originalmente en los mosquitos Anopheles stephensi6. Esta especie se considera una causa emergente de miositis pero también se asoció con infecciones de cuerdas vocales, piel, oculares o diseminadas principalmente en pacientes inmunodeprimidos7. También se sabe que A. algerae desarrolla infecciones en ratones SCID8 y más recientemente se demostró que infecta a Drosophila melanogaster9. In vitro, esta especie de microsporidios se puede cultivar en una amplia gama de líneas celulares que incluyen células de insectos10, peces11 y mamíferos12.

Los microsporidios se caracterizan por una forma infecciosa y altamente resistente en el medio ambiente, la espora, cuyo tamaño varía de aproximadamente 1 a 20 µm según la especie. La espora está rodeada por una pared celular gruesa y rígida que delimita el esporoplasma, es decir, el contenido infeccioso del parásito13. Los microsporidios también reciben gran atención debido a su orgánulo único llamado tubo polar, que participa en uno de los mecanismos de invasión más fascinantes. Cuando las esporas se exponen a condiciones ambientales no bien definidas, esta estructura enrollada altamente especializada se extruye rápidamente y forma un tubo hueco necesario para el transporte y entrega del esporoplasma (incluido el núcleo) al citoplasma de la célula huésped14. Este proceso llamado germinación de esporas ocurre en menos de 2 s.

El tubo polar es un complejo multiproteico conocido por resistir la disociación en detergentes y ácidos, pero se solubiliza con agentes reductores como el ditiotreitol (DTT) o el 2-mercaptoetanol (2-ME), lo que sugiere que los puentes disulfuro desempeñan un papel importante en la estabilización de esta estructura15. Los estudios realizados hasta ahora sobre su composición han dado como resultado la identificación de proteínas centrales conocidas como proteínas del tubo polar (PTP). Se describieron seis PTP (PTP1 a PTP6) en numerosas especies de microsporidios15,16. PTP1, el primer componente del tubo polar identificado tanto en Encephalitozoon cuniculi como en E. hellem17,18, es una proteína ácida rica en prolina. Además, esta PTP está O-manosilada y se caracteriza por un alto grado de divergencia de secuencia entre especies19,20. Las proteínas PTP2 son proteínas ricas en lisina y tienen un punto isoeléctrico básico. Tanto PTP1 como PTP2 presentan muchos residuos de cisteína que podrían estar involucrados en puentes disulfuro intra y/o interproteicos. Se demostró que los genes ptp1 y ptp2 de Encephalitozoon spp están organizados en grupos y esta organización parece conservarse entre varios genomas de microsporidios21,22. PTP3, descrita por primera vez en E. cuniculi mediante inmunodetección de una biblioteca de ADNc23, es una proteína de mayor peso molecular (> 1100 aa) rica en aminoácidos cargados y, a diferencia de PTP1 y PTP2, es soluble en ausencia de un agente reductor de tiol. Las proteínas de la familia PTP3 se encuentran en todos los proteomas de microsporidios disponibles y demostraron estar más conservadas que PTP1 y PTP2. Curiosamente, tanto los extractos de proteínas de tubos polares reticulados como los ensayos de dos híbridos de levadura revelaron que PTP1, PTP2 y PTP3 interactúan entre sí23,24. Al carecer de cisteína, la PTP3 podría ser una proteína de andamio mediante la interacción con otras PTP. Posteriormente, un enfoque proteómico en E. cuniculi permitió la identificación de dos nuevas PTP denominadas PTP4 y PTP525. La proteína PTP4 de E. cuniculi es rica en glutamato, mientras que PTP5 es rica en residuos de lisina y presenta un 20% de similitudes con la secuencia de PTP426. Al igual que los genes ptp1 y ptp2, los genes ptp4 y ptp5 también se encuentran en grupos y los ortólogos están presentes en muchos genomas de microsporidios15. La PTP6 identificada más recientemente, descrita en el parásito del gusano de seda Nosema bombycis, es una proteína rica en histidina y serina cuyos ortólogos se identifican sólo en un número limitado de especies (Encephalitozoon spp y N. ceranae, un parásito de las abejas) y pueden unirse a la superficie de la célula huésped16. Debido a las altas tasas de evolución de los microsporidios, los PTP se caracterizan por un alto grado de divergencias de secuencia entre especies, lo que dificulta la identificación de ortólogos.

Finalmente, los estudios destacaron el papel de algunas PTP en los procesos de invasión a través de interacciones con la superficie de la célula huésped. PTP1 a través de sus sitios de manosilación ligados a O probablemente interactúa con los receptores de unión a manosa de la célula huésped, facilitando la adherencia del tubo polar a la membrana de la célula huésped19,20. Más recientemente, se demostró que un epítopo único de E. hellem PTP4 localizado específicamente en la punta del tubo polar extruido se une al receptor 1 de transferrina del huésped. Se demostró que esta interacción desempeña un papel clave en la invasión de microsporidios27.

El objetivo de nuestro estudio fue caracterizar la diversidad de PTP en A. algerae utilizando diferentes enfoques complementarios, incluida la búsqueda de homología y extracciones diferenciales de proteínas esporales con altas concentraciones de agentes reductores de tiol asociados con enfoques basados ​​en anticuerpos. También desarrollamos un protocolo para purificar tubos polares extruidos combinados con espectrometría de masas para identificar posibles nuevos componentes de tubos polares. Estas estrategias nos permitieron identificar 7 PTP con distinta localización en los tubos polares extruidos. Curiosamente, se demostró que PTP3 estaba ausente en la punta de los tubos polares extruidos, mientras que tanto PTP4 como el PTP7 recientemente identificado solo tiñeron el extremo terminal de los tubos polares, lo que sugiere un papel de estas proteínas en la unión a los receptores de la célula huésped durante proceso de invasión.

Una búsqueda tBLASTn contra el genoma de A. algerae utilizando secuencias de PTP de diferentes especies de microsporidios permitió la identificación de CDS que comparten homologías con las cinco familias de PTP descritas anteriormente. Se identificaron secuencias completas de genes que codifican PTP1 (407 aa, WAQ68434), PTP3 (1203 aa, WAQ68436), PTP4 (254 aa, WAQ68438) y PTP5 (240 aa, WAQ68439) (Tabla 1). PTP1 se caracteriza por un alto contenido de prolina (32%) y un punto isoeléctrico ácido. Esta proteína contiene 13 residuos de cisteína y una gran cantidad de sitios potenciales de O-glicosilación. PTP3 es una proteína de alto peso molecular (127 kDa) con un pI ácido y riqueza en residuos de alanina y glutamato. Esta PTP contiene sólo dos residuos de cisteína y, de manera similar a la PTP1, se caracteriza por la presencia de numerosos sitios potenciales de O-glicosilación. Tanto la proteína PTP4 como la PTP5 son proteínas más pequeñas ricas en lisina con pesos moleculares similares de 28 kDa. Se encontraron tres secuencias parciales que codifican proteínas similares a PTP2 en los datos de ensamblaje del genoma de A. algerae. Varían de 418 a 492 aa de longitud y carecen de la parte N-terminal, lo que sugiere la presencia de diferentes genes que codifican PTP2 o variantes alélicas (consulte la figura complementaria S1). Un enfoque 5'-RACE-PCR permitió la identificación de la secuencia completa de la proteína PTP2c. La proteína completa PTP2c (535 aa, WAQ68435) tiene un punto isoeléctrico básico con una región N-terminal rica en serina y glicina. La alineación de secuencia de las tres proteínas similares a PTP2 revela que se caracterizan por una región C-terminal rica en lisina altamente conservada y una parte N-terminal variable que contiene una gran cantidad de motivos repetidos ricos en serina y glicina (consulte la figura complementaria S1). . Estas secuencias también contienen 8 residuos de cisteína en posiciones conservadas en su parte C-terminal.

Se produjeron PTP parciales recombinantes (PTP2, PTP3, PTP4 y PTP5) en E. coli, se purificaron por afinidad y se inyectaron en ratones para producir anticuerpos específicos. Desafortunadamente, no logramos expresar todo el PTP1 en E. coli, y los intentos de expresar solo la parte N-terminal o la parte C-terminal de PTP1 tampoco tuvieron éxito (consulte la Tabla complementaria S1). De este modo se produjeron anticuerpos anti-PTP1 en conejos contra dos péptidos sintéticos de la proteína. Luego se utilizaron los diferentes antisueros para detectar cada PTP tanto en extractos proteicos de A. algerae como en IFA. Los anticuerpos contra los péptidos PTP1 reconocieron específicamente una banda proteica única de 75 kDa de tamaño (Fig. 1). Esta banda, de tamaño superior al esperado, sólo se detectó cuando las proteínas esporales se solubilizaron en presencia de DTT. De manera similar, los anticuerpos de ratón generados contra la PTP2 recombinante reaccionaron con lisados ​​celulares de esporas de A. algerae solo en el extracto de DTT. Estos anticuerpos reconocieron consistentemente dos bandas de proteínas muy cercanas a ~ 70 y 75 kDa (Fig. 1). Por el contrario, una banda de proteína de alrededor de 180 kDa se tiñó con anticuerpos anti-PTP3 en extractos de proteínas sin ningún agente reductor. Finalmente, los antisueros PTP4 también reconocieron proteínas en el extracto SDS, con dos bandas principales a 75 y 35 kDa. Desafortunadamente, los antisueros generados contra PTP5 no detectaron ninguna banda de proteína (consulte la Figura complementaria S2). Luego se realizó un análisis de microscopía de inmunofluorescencia en esporas germinadas de A. algerae (Fig. 2 y consulte la Fig. S2 complementaria y la Tabla S2). Los tubos polares extruidos de longitud completa se marcaron fuertemente con anticuerpos anti-PTP1 (Fig. 2a – c) y anti-PTP2 (Fig. 2d – f). Curiosamente, los anticuerpos generados contra PTP3 marcaron una gran parte del tubo polar extruido, excepto su extremo terminal (Fig. 2g-i). Por el contrario, se observó un marcado fuerte restringido al extremo terminal de los tubos polares extruidos utilizando anticuerpos anti-PTP4 (Fig. 2j-l).

Inmunodetección de PTP en extractos de proteínas esporales de A. algerae. (a) SDS-PAGE al 10% teñido con azul de Coomassie de proteínas extraídas de esporas de A. algerae. La primera extracción se realizó en SDS al 2,5% (carril 1). Luego, las proteínas insolubles se solubilizaron en un tampón que contenía DTT 100 mM (carril 2). (b) Análisis de transferencia Western utilizando antisueros generados contra PTP1, PTP2, PTP3 y PTP4 en extractos de SDS (carril 1) y DTT (carril 2). PTP1 y PTP2 sólo son solubles en presencia de agente reductor (flechas). Por el contrario, en el extracto SDS se detectan PTP3 y PTP4 (flechas). Todos los antisueros se utilizaron en una dilución de 1:200.

Ensayo de inmunofluorescencia indirecta que utiliza antisueros generados contra PTP recombinantes que revelan la ubicación específica de cada PTP en tubos polares extruidos de A. algerae. Las esporas germinadas se visualizan en contraste de fases (a,d,g,j) y después del marcaje anti-PTP1 (b), anti-PTP2 (e), anti-PTP3 (h) y anti-PTP4 (k). Las imágenes fusionadas se generaron con el software GIMP 2.10.8 (c,f,i,l). Los anticuerpos contra las proteínas PTP1 y PTP2 marcaron todo el tubo polar. Por el contrario, los anticuerpos contra la proteína PTP3 marcaron una gran parte del tubo polar excepto la extremidad, mientras que los anticuerpos anti-PTP4 marcaron exclusivamente la extremidad del tubo polar (flechas). Todos los antisueros se utilizaron en una dilución de 1:100. El anticuerpo secundario era IgG anti-ratón (o anti-conejo para PTP1) de cabra conjugado con Alexa 488. Se observaron al menos 10 campos diferentes, lo que corresponde a ~ 50 a 130 esporas con su tubo polar extruido. Consulte la Fig. S2 complementaria para ver imágenes adicionales que ilustran las diferentes localizaciones de los PTP. Tubo polar PT, espora S, esporoplasma SP. Barra de escala: 10 µm.

Para identificar posibles nuevos componentes del tubo polar, se realizaron extracciones diferenciales de proteínas de esporas de A. algerae utilizando altas concentraciones de DTT y 2-mercaptoetanol (2-ME). La primera extracción de proteínas se realizó en un tampón que contenía DTT 100 mM. Luego, el sedimento insoluble se incubó en 2-ME al 50%. El análisis SDS-PAGE de esta fracción final reveló la presencia de una banda proteica predominante a 75 kDa (Fig. 3a). También se detectaron otras bandas de proteínas, incluida una de alrededor de 180 kDa. Luego se produjeron antisueros de ratón contra las bandas de 75 y 180 kDa. En IFA, estos antisueros marcaron específicamente el tubo polar extruido de A. algerae (Fig. 3b, c). Tenga en cuenta el etiquetado menos intensivo en el extremo terminal del tubo polar extruido con anticuerpos generados contra la banda de proteína de 180 kDa (Fig. 3b). Como se esperaba, el análisis de espectrometría de masas identificó tanto PTP1 como PTP2 en la banda de proteína de 75 kDa. También se encontraron otras seis proteínas en esta banda, 5 de ellas con una función prevista (Tabla 2 y consulte la Tabla complementaria S3). En la banda de 180 kDa se encontraron cinco proteínas. La mayoría de los péptidos identificados (43) eran específicos de una secuencia proteica parcial (678 aa de longitud) con función desconocida pero relacionada con la familia PTP3. En esta banda también se recuperaron una proteína similar a la ubiquitina ligasa E3 y otra proteína con función desconocida. Sorprendentemente, no se identificó ningún péptido coincidente con PTP3, mientras que se encontraron péptidos específicos de PTP1 y PTP2. Esta proteína similar a PTP3 se denominó PTP3b. El CDS completo, obtenido mediante el ensamblaje de datos de RNAseq, codifica una proteína de 1197 aa (121 kDa, WAQ68437) con un péptido señal predicho de 15 aa (Tabla 1).

Los anticuerpos producidos contra dos bandas de proteínas de A. algerae solubles en una alta concentración de 2-mercaptoetanol marcaron específicamente el tubo polar extruido. ( a ) SDS-PAGE (10%) de extractos de proteínas esporales obtenidos primero en un tampón que contiene DTT 100 mM. Luego, la fracción insoluble se incubó en una solución de 2-mercaptoetanol (2-ME) al 50%. Se seleccionaron dos bandas de proteínas que funcionan a 75 y 180 kDa (flechas) en el extracto 2-ME para producir anticuerpos de ratón y se analizaron en espectrometría de masas (consulte la Tabla S2). ( b, c ) IFA con antisueros de ratón generados contra bandas de proteínas de 180 kDa (b) y 75 kDa (c). Ambos antisueros marcaron todo el tubo polar de esporas de A. algerae germinadas, pero la señal fue menos intensa en el extremo del tubo con el antisuero anti-180 kDa (flecha). Se utilizaron antisueros de ratón a una dilución de 1:100. El anticuerpo secundario era IgG anti-ratón de cabra conjugado con Alexa 488. Las imágenes fusionadas se generaron con el software GIMP 2.10.8. tubo polar PT; espora; Barra de escala: 10 µm.

La alineación de secuencia de las proteínas PTP3 y PTP3b reveló que estas dos proteínas presentan un 29,1% de identidad (consulte la figura complementaria S3). Sin embargo, estas proteínas PTP3 presentan características bioquímicas conservadas que incluyen un peso molecular alto similar (121 frente a 127 kDa), un punto isoeléctrico ácido cercano a 5 y una riqueza en residuos de alanina (Tabla 1). Para confirmar que PTP3b es un nuevo componente del tubo polar, se produjeron anticuerpos contra una proteína parcial recombinante expresada en E. coli. Como se esperaba, estos anticuerpos reaccionaron con una banda cercana a los 180 kDa pero superior a la del PTP3. En IFA, estos anticuerpos marcaron específicamente el polar extruido de A. algerae con una tinción tenue en la parte terminal del tubo (Fig. 4 y consulte la Fig. S2 complementaria y la Tabla S2).

Los anticuerpos producidos contra el PTP3b recombinante marcaron específicamente el tubo polar extruido. ( a ) Inmunotransferencia con anti-PTP3 y anti-PTP3b contra extracto de proteína esporal total de A. algerae (10% SDS-PAGE). PTP3b se detecta con un peso molecular más alto que PTP3 (flechas). Las otras bandas más bajas detectadas probablemente corresponden a la degradación de proteínas. (b) IFA con anticuerpos anti-PTP3b. Todo el tubo polar extruido está teñido pero con una señal menos intensa en la parte terminal del tubo (flecha blanca). (c) contraste de fases. Se observaron al menos 10 campos diferentes, lo que corresponde a ~ 50 a 130 esporas con su tubo polar extruido. Consulte la Fig. S2 complementaria para ver imágenes adicionales que ilustran las diferentes localizaciones de los PTP. tubo polar PT; Espora S, barra de escala: 10 µm.

Desarrollamos un método para disociar y purificar tubos polares de esporas germinadas de A. algerae. Primero, se incubaron esporas de A. algerae en un tampón de germinación a 20 °C durante 2 h. El porcentaje de esporas germinadas determinado por IFA utilizando anticuerpos generados contra el tubo polar fue cercano al 80% (Fig. 5a-d y consulte la Fig. S4 complementaria y la Tabla S2). Luego, los tubos polares se fragmentaron mediante sonicación y se purificaron mediante 3 centrifugaciones sucesivas (Fig. 5e-h). El etiquetado DAPI mostró que esta fracción de PT enriquecida también contiene esporoplasmas en tránsito en algunos tubos polares. Luego se recuperaron los tubos polares en el tercer sobrenadante y se extrajeron las proteínas en presencia o ausencia de agentes reductores. El análisis de transferencia Western reveló la presencia de las cuatro proteínas del tubo polar PTP1, PTP2, PTP3 y PTP4 en los diferentes extractos de tubos polares. Como se esperaba, tanto PTP1 como PTP2 solo se detectaron en extractos de proteínas con DTT, mientras que PTP3 y PTP4 fueron solubles en ausencia de DTT (Fig. 6a). Luego se realizó un análisis de espectrometría de masas en estos extractos de tubos polares purificados. Al combinar los 3 extractos, se identificaron un total de 214 proteínas únicas (consulte la Tabla complementaria S3): 136 proteínas en el extracto total, 142 en el extracto SDS y 122 en el extracto secuencial TDT. Aunque en estos extractos se identificaron las proteínas PTP1, PTP2, PTP3b y PTP4, no se encontró ningún péptido específico de PTP3 y PTP5 (Tabla 3). Entre las 214 proteínas, también se identificaron proteínas estructurales como proteínas de la pared de esporas, proteínas ribosómicas, proteínas involucradas en la replicación, transcripción, traducción, señalización y vías metabólicas (Fig. 6b y consulte la Tabla complementaria S3). Más interesante aún, se identificaron 26 proteínas hipotéticas con función desconocida y 14 de ellas presentan un péptido señal predicho que sugiere que pueden secretarse (Tabla 3). Seis de estas proteínas potencialmente secretadas se expresaron en E. coli y se inyectaron en ratones para producir anticuerpos específicos. Uno de ellos, del que se obtuvo el CDS completo mediante ensamblaje de datos de RNAseq y correspondiente a una proteína rica en treonina de 417 aa (WAQ68440), demostró localizar en el extremo terminal del tubo polar extruido un marcaje similar al observado. con anticuerpos anti-PTP4 (Fig. 7a). En la transferencia Western, estos anticuerpos detectaron una única banda proteica de alrededor de 60 kDa solo en extractos proteicos que contenían agentes reductores (Fig. 7b). Este nuevo componente del tubo polar llamado PTP7 no tenía homología con otros PTP y proteínas de las bases de datos. Sólo se encontró una proteína ortóloga en la especie de microsporidios estrechamente relacionada Tubulinosema ratisbonensis.

Purificación de tubos polares de A. algerae. Se incubaron 109 esporas de A. algerae en PBS (a,b) o en una solución que contenía NaHCO3-Na2CO3 0,2 M a pH 9,5 durante 2 h a 20 °C para estimular la germinación (c,d). Luego se disociaron los tubos polares de las esporas germinadas y se fragmentaron (e,f). Finalmente, los tubos polares fragmentados se purificaron mediante 3 centrifugaciones sucesivas (g,h). En cada paso, se recogió y analizó material biológico mediante tinción DAPI (a,c,e,g) y mediante IFA (b,d,f,h) utilizando anticuerpos policlonales de ratón generados contra el tubo polar (anticuerpos anti-PTP3). Los tubos polares fragmentados y purificados se indican con flechas. En la fracción final de tubos polares purificados, algunos tubos polares fragmentados se marcan con DAPI (g, *). Tubo polar PT, espora S. Barras de escala: 10 µm.

Análisis de la fracción de tubos polares purificada. ( a ) Inmunodetección de PTP en extractos de proteínas de tubos polares purificados de A. algerae. Se aplicaron anticuerpos policlonales anti-PTP a 3 extractos de proteínas diferentes de tubos polares purificados. El extracto total (carril 1) contiene proteínas solubles en SDS al 2,5% y DTT 100 mM. Los otros dos extractos corresponden a una extracción proteica diferencial. Las proteínas de los tubos polares purificados se solubilizaron primero con SDS al 2,5 % (carril 2), luego las proteínas insolubles se extrajeron en un tampón que contenía DTT 100 mM (carril 3). Tanto PTP1 como PTP2 solo eran solubles en presencia de agentes reductores (carril 3, flechas). Por el contrario, los antisueros anti-PTP3 y anti-PTP4 detectaron bandas de proteínas en el extracto de SDS sin DTT (carril 2). Para PTP3, también se tiñó una banda adicional de alrededor de 63 kDa en el extracto total. Para PTP4, el extracto SDS reveló tres bandas de 75, 35 y <10 kDa (carril 2). Todos los antisueros se utilizaron en una dilución de 1:200. (b) Clasificación funcional y distribución de las 214 proteínas identificadas por espectrometría de masas en la fracción del tubo polar purificada utilizando la predicción InterProScan (consulte la Tabla S3).

Localización del PTP7 recién identificado en el extremo terminal del tubo polar extruido. (a) IFA con antisuero de ratón anti-PTP7 (dilución 1:100) que revela un etiquetado específico del extremo terminal del tubo polar extruido de A. algerae (flecha). Los anticuerpos secundarios fueron IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa 488. Se observaron al menos 10 campos diferentes, lo que corresponde a ~ 50 a 130 esporas con su tubo polar extruido. Consulte la Fig. S2 complementaria para ver imágenes adicionales que ilustran las diferentes localizaciones de PTP7. tubo polar PT; espora; Barra de escala: 10 µm. (b) Análisis de transferencia Western en proteínas esporales solubilizadas primero en presencia de SDS al 2,5% (extracto de SDS) y luego en una solución que contiene DTT 100 mM (extracto de DTT). El antisuero reaccionó con una banda proteica esporal única de A. algerae a aproximadamente 60 kDa en el extracto de DTT (flecha).

El tubo polar es un orgánulo altamente especializado involucrado en el proceso único de invasión de la célula huésped utilizado por los parásitos microsporidios. Tras una estimulación ambiental adecuada, esta estructura tubular hueca que se enrolla alrededor del interior de la espora se extruye repentinamente y se utiliza para transportar el esporoplasma infeccioso al citoplasma de la célula huésped28,29. Se identificaron cinco proteínas del tubo polar denominadas PTP1 a PTP5 y se demostró que están presentes en la mayoría de las especies de microsporidios, pero se sabe poco sobre la formación del tubo polar y la función de los componentes que forman esta estructura15,26. Aunque las PTP comparten características comunes dentro de cada familia (por ejemplo, riqueza de prolina para PTP1, pI básico para PTP2, propiedades de solubilidad, orden genético conservado para ptp1 y ptp2), se caracterizan por un alto nivel de variabilidad en la secuencia de aminoácidos entre especies. Por lo tanto, la identificación de PTP a menudo requiere una combinación de búsquedas de similitud de secuencias en bases de datos y comparación de propiedades bioquímicas y organización genética. Por ejemplo, la relación sinténica de los genes ptp1 y ptp2 facilitó su identificación a pesar de sus fuertes divergencias de secuencia en los microsporidios de insectos Antonospora locustae y Paranosema grylli22. En el presente estudio, logramos la identificación de los genes que codifican proteínas ortólogas pertenecientes a las 5 familias de PTP en Anncaliia algerae. Como se esperaba, estas proteínas, en particular el componente principal de PT, PTP1, se caracterizan por un alto grado de divergencia en la secuencia de aminoácidos en comparación con sus ortólogos en otras especies de microsporidios. Aunque los genes ptp1 y ptp2 se encontraron en el mismo locus genómico en numerosos genomas de microsporidios, incluidos los de Encephalitozoon spp.21, A. locustae y P. grylli30, esta organización en tándem no parece conservarse en A. algerae. Sorprendentemente, el análisis de los datos genómicos de A. algerae también reveló la presencia de tres secuencias parciales que codifican PTP2, pero solo se obtuvo la secuencia completa de una de ellas mediante RACE PCR (ver Figura complementaria S1). Estas proteínas relacionadas con PTP2 se caracterizan por una región C-terminal altamente conservada con muchos residuos de cisteína y contienen una extensión N-terminal divergente rica en glicina y serina, como se observó previamente en A. locustae y P. grylli30. La presencia de múltiples proteínas similares a PTP2 se confirmó mediante análisis de transferencia Western cuando los anticuerpos anti-PTP2 reaccionaron con varias bandas de proteínas (Fig. 1). Un estudio reciente realizado en el parásito del gusano de seda Nosema bombycis ha revelado la presencia de una nueva PTP denominada NbPTP616. Se demostró que esta PTP rica en residuos de histidina y serina se une a la superficie de la célula huésped, pero parece estar menos conservada en Microsporidia. Además, no pudimos encontrar una proteína ortóloga en A. algerae.

Para completar nuestro conocimiento sobre la composición del tubo polar en A. algerae, combinamos dos enfoques. El primero se basó en las propiedades de solubilidad del tubo polar y el segundo implicó la purificación y análisis proteómico de una fracción de tubo polar extruido. Como se ha demostrado que el tubo polar está completamente disociado en presencia de agentes reductores15, se realizaron extracciones diferenciales de proteínas utilizando altas concentraciones de DTT y/o 2-ME. Se seleccionaron dos bandas principales que migraban a 75 y 180 kDa de un extracto de proteína 2-ME al 50%. Como se esperaba, la banda de proteína de 75 kDa contiene tanto PTP1 como PTP2; se ha demostrado que estas dos proteínas co-migran en SDS-PAGE (Fig. 1). Más sorprendentemente, no se identificó PTP3 en la banda de proteína de 180 kDa. Sin embargo, el análisis proteómico de esta banda reveló la presencia de una proteína similar a PTP3, denominada PTP3b. PTP3 y PTP3b son muy divergentes (solo el 29% de la identidad de secuencia, consulte la figura complementaria S3), pero comparten características comunes que incluyen un alto peso molecular, un pI ácido y una riqueza de glutamato y alanina. También se identificaron dos genes codificantes de PTP3 en el genoma recientemente secuenciado de T. ratisbonensis, una especie estrechamente relacionada con A. algerae31 o en el parásito del mosquito Edhazardia aedis, mientras que se identificó un solo gen ptp3 en todos los demás genomas de microsporidios secuenciados hasta ahora15.

El segundo enfoque para identificar nuevas PTP de A. algerae consistió en desarrollar un método para purificar tubos polares a partir de esporas germinadas. Recientemente se utilizó una estrategia similar en Nosema bombycis y se identificaron diez proteínas secretadas desconocidas sin ningún dominio conservado como posibles PTP novedosas, pero no se demostró la localización PT de estas proteínas32. En nuestro estudio, primero seleccionamos y optimizamos un protocolo de germinación para A. algerae26 que generó ~ 80% de esporas con tubo polar extruido. Luego se disociaron los tubos polares de las esporas germinadas, se fragmentaron mediante sonicación y se purificaron mediante sucesivas centrifugaciones. PTP1, PTP2, PTP3, PTP3b y PTP4, pero no PTP5, se identificaron en los extractos del tubo polar, como lo demuestra el análisis de transferencia Western (Fig. 6) y/o espectrometría de masas (Tabla 3). Entre las 214 proteínas identificadas mediante espectrometría de masas, también encontramos 14 proteínas secretadas con función desconocida que podrían representar nuevas PTP potenciales, pero solo se produjeron anticuerpos de ratón contra 6 proteínas seleccionadas. Los análisis IFA revelaron que una de estas proteínas corresponde a una nueva proteína del esporoplasma (no mostrada), mientras que otra es una nueva PTP, denominada PTP7, que no presenta homología con las otras familias de PTP, incluida la PTP6 recientemente identificada en N. bombycis. La búsqueda de homología solo identificó un PTP7 ortólogo en T. ratisbonensis, lo que sugiere que este PTP7 está ausente en la mayoría de los genomas de microsporidios o es altamente divergente, lo que dificulta su identificación. Por lo tanto, podemos plantear la hipótesis de que ciertas PTP podrían ser específicas de algunas especies de microsporidios, probablemente en relación con su especificidad de huésped. El análisis de extractos de PT purificados también reveló la presencia de varias proteínas de la pared de las esporas (SWP). Esto puede explicarse por el hecho de que las interacciones entre PTP y SWP y el papel desempeñado por algunos SWP en la formación y orientación del tubo polar se han descrito previamente en N. bombycis33,34. Por ejemplo, se demostró que SWP9 es una proteína de andamiaje que ancla y sostiene el tubo polar pero también une el tubo polar a la pared de la espora35. Por lo tanto, la orientación, disposición y anclaje del tubo polar al disco de anclaje dependerían de las interacciones PTP-SWP. Más sorprendentemente, en la fracción de tubo polar purificada también se encontraron numerosas proteínas implicadas en procesos de replicación y traducción, señalización celular o metabolismo. Probablemente corresponden a proteínas del esporoplasma en tránsito en tubos polares extruidos (como lo demuestra el etiquetado DAPI), que contaminaron así las fracciones de los tubos polares. De manera similar, también se identificaron una gran cantidad de proteínas, incluido este tipo de proteínas, a partir de tubos polares purificados de N. bombycis32. Para respaldar nuestra hipótesis, podríamos analizar el contenido de proteínas de los esporoplasmas de A. algerae purificados utilizando el protocolo desarrollado recientemente para la purificación de esporoplasmas de N. bombycis36.

La producción de anticuerpos contra las PTP de A. algerae nos permitió analizar su solubilidad y precisar su localización. PTP1, PTP2 y PTP7 solo se recuperaron en extractos de proteínas que contenían DTT, como se describió anteriormente para todos los PTP1 y PTP221,22,30 identificados. Esto es coherente con la presencia y conservación de varios residuos de cisteína muy probablemente involucrados en enlaces disulfuro intra y/o intermoleculares necesarios para el ensamblaje de tubos polares24. A diferencia de PTP1 y PTP2, PTP3, PTP3b y PTP4 eran solubles en SDS solo como se describe para E. cuniculi PTP323. Las proteínas de la familia PTP3 contienen algunos residuos de cisteína y se ha sugerido que interactúan con otras PTP a través de enlaces iónicos durante la formación de PT23,24. PTP4, con un tamaño previsto de 28 kDa, se detecta tanto a 35 como a 75 kDa en ausencia de agente reductor, pero solo se une a la banda de 35 kDa en el extracto soluble en DTT. Nuestra hipótesis es que la banda más alta detectada sin DTT podría corresponder a homodímeros establecidos mediante enlaces disulfuro. Sin embargo, esta hipótesis debe ser probada mediante dos híbridos de levadura o experimentos de inmunoprecipitación. Finalmente, el análisis de transferencia Western reveló que PTP1, PTP2 y las dos proteínas PTP3 mostraban pesos moleculares mayores que sus tamaños previstos. De hecho, tanto PTP1 (39 kDa) como PTP2 (49 kDa) co-migran alrededor de 75 kDa, mientras que PTP3 (127 kDa) y PTP3b (121 kDa) se detectan en bandas de peso molecular más altas pero diferentes, cercanas a 180 kDa. También se observó un defecto de migración para el PTP7 recientemente identificado con una sola banda que migra a ~ 55/60 kDa para un tamaño previsto de 45 kDa. Para PTP1, el contenido muy alto en residuos de prolina (32%) podría contribuir a esta migración anómala, observada también para la mayoría de PTP118,21,22, ya que es bien sabido que las proteínas ricas en prolina funcionan más lentamente durante la SDS-PAGE. Lo más probable es que la causa de la migración aberrante pueda deberse a modificaciones postraduccionales como la glicosilación. De hecho, todos los PTP1-3 y PTP7 contienen numerosos sitios potenciales de O-glicosilación y se demostró que algunas proteínas de la familia PTP1 están O-manosiladas20,22. Se ha sugerido que tales modificaciones estarían implicadas en la adherencia del PT a la superficie de la célula huésped mediante interacciones con receptores de unión a manosa19. Sin embargo, es necesario aclarar el estado de glicosilación de las otras PTP.

Nuestro estudio también reveló que las 6 PTP de A. algerae mostraron diferentes localizaciones en el tubo polar extruido. Como se describe en otras especies, las proteínas PTP1 y PTP2 están ubicadas uniformemente a lo largo de todo el tubo polar extruido. Esto es consistente con el hecho de que PTP1 se considera el componente principal del tubo polar y se demostró que interactúa consigo mismo y con PTP2 y PTP3 en la formación del tubo polar en E. cuniculi24. Por el contrario, PTP3 está presente en una amplia parte del tubo polar completamente extruido excepto en su extremo terminal. Sin embargo, cuando el esporoplasma todavía está en la espora o en tránsito en el PT extruido, el tubo estaba totalmente marcado con anticuerpos anti-PTP3 de acuerdo con (i) el modelo de tubo polar que "evierte como el dedo de un guante"37 y el hecho de que El material infeccioso inicia su transferencia mientras solo se extruye el 50% del tubo14 (consulte la figura complementaria S2). Por lo tanto, cuando comienza la transferencia de esporoplasma, la extremidad PT no sería accesible, lo que provocaría una tinción del tubo polar de longitud completa con anticuerpos anti-PTP3. A diferencia de PTP3, PTP3b está presente en todo el tubo polar con un etiquetado menos intensivo en su extremo, como se observa con PTP3 de Nosema pernyi38. Finalmente, los anticuerpos contra PTP4 y PTP7 recientemente identificados demuestran una localización similar de ambas proteínas restringida a la punta del tubo polar, correspondiente a la región que no estaba marcada con anticuerpos anti-PTP3. Sin embargo, algunos tubos polares extruidos no estaban marcados con estos anticuerpos, observándose también la ausencia de marcaje para las esporas germinadas con su esporoplasma todavía dentro de la espora o en tránsito en el tubo polar extruido. En estos casos, el tubo polar no se extruyó completamente y su extremo no sería accesible para los anticuerpos (consulte la Figura S2 complementaria y la Tabla S2). Nuestros datos de IFA deben completarse mediante inmunomarcaje TEM, en particular para precisar la ubicación de los diferentes PTP cuando el tubo polar todavía está enrollado dentro de la espora. En E. hellem, un anticuerpo monoclonal contra PTP4 marcó solo la punta del tubo polar y se demostró que un epítopo de esta proteína puede interactuar con el receptor 1 de transferrina de la célula huésped para iniciar el proceso de invasión27. Podemos plantear la hipótesis de que PTP4 podría desempeñar un papel similar en A. algerae. La misma localización de PTP7 también defiende el papel de este PTP en el reconocimiento del potencial receptor de la célula huésped durante el proceso de invasión. Para concluir, nuestro estudio proporciona nuevos avances en la composición del tubo polar, pero las interacciones entre las PTP necesarias para el ensamblaje del tubo polar y su papel respectivo durante el proceso de invasión siguen siendo enigmáticas.

El aislado secuenciado de A. algerae utilizado en este estudio39 fue amablemente proporcionado por el profesor WA Maier (Universidad de Sigmund-Freud, Bonn) y corresponde al microsporidio aislado por el Dr. A. Undeen de su mosquito huésped original (A. stephensi). Este aislado se propagó in vitro en células de riñón de conejo (RK13, ATCC CCL-37) o de fibroblastos de prepucio humano (HFF, ATCC SRC-1041), en medio mínimo esencial (MEM) suplementado con suero fetal de ternera al 5%, l-2 mM. glutamina, 0,25 µg.mL-1 de anfotericina B y 25 µg.mL-1 de gentamicina, a 30 °C en una atmósfera de 5% de CO2. Los sobrenadantes que contenían esporas se recogieron cada 72 h. Después de la centrifugación durante 3 minutos a 6000 xg, las esporas se lavaron 3 veces en tampón PBS y se almacenaron a 4 °C.

Se utilizaron como consulta las secuencias de PTP descritas en otras especies de microsporidios y disponibles en las bases de datos NCBI y/o MicrosporidiaDB (https://microsporidiadb.org/micro/app). Utilizando estas secuencias, se realizó una búsqueda por homología de secuencia frente al genoma de A. algerae utilizando BLAST con la configuración predeterminada. A continuación, se caracterizaron las secuencias identificadas en el genoma de A. algerae con diferentes herramientas bioinformáticas. Los péptidos señal N-terminal se predijeron utilizando una combinación de SignalP-5.0 (//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), TargetP-2.0 (//www.cbs.dtu.dk/services /TargetP/) y herramientas Phobius (https://phobius.sbc.su.se/). El punto isoeléctrico teórico, el peso molecular y la composición de aminoácidos se determinaron con la herramienta ExPASy ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/). Los sitios potenciales de O-glicosilación se predijeron con el servidor NetOGlyc 4.0 (//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/). Los dominios funcionales y los términos de ontología genética se determinaron con la herramienta InterPro 86.0 (//www.ebi.ac.uk/interpro/). Se realizaron múltiples alineamientos de secuencias utilizando el software ClustalOmega (//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

Se liberó ADN de A. algerae a partir de 1.7.108 esporas utilizando el kit NucleoSpin® Soil (Macherey-Nagel). Las secuencias que codifican las PTP de interés se amplificaron mediante PCR con 130 ng de ADN, 500 nM de cada cebador específico (consulte la Tabla complementaria S1), dNTP 0,2 mM y 1,25 U de ADN polimerasa GoTaq® (Promega). Las amplificaciones por PCR se realizaron utilizando un ciclador térmico ProFlex PCR System (Applied Biosystems). Después de la desnaturalización a 94 °C durante 2 min, se ejecutaron 30 ciclos con 30 s de desnaturalización a 94 °C, 30 s de hibridación entre 56 y 60 °C y 40 a 90 s de extensión a 72 °C. Los productos de la PCR se separaron en gel de agarosa al 1% y se purificaron utilizando el kit de extracción en gel de limpieza de PCR (Macherey-Nagel). Luego, los productos de la PCR se digirieron con las enzimas de restricción correspondientes (consulte la Tabla complementaria S1, Promega) y se clonaron en el vector de expresión pGEX-4T1 en marco con glutatión-S-transferasa (GST) y una etiqueta de 6 histidinas en el C-terminal. Los plásmidos recombinantes resultantes se introdujeron en la cepa E. coli BL21+. Después de la inducción a 37 °C con IPTG 1 mM durante 4 h, las proteínas bacterianas se solubilizaron en SDS al 2,5 % y 2-mercaptoetanol al 10 % y luego se analizaron mediante SDS-PAGE. Luego, cada proteína recombinante se purificó en perlas de glutatión según las instrucciones del proveedor (Glutathione Sepharose® 4B, GE Healthcare).

Las células HFF se infectaron con 107 esporas de A. algerae y los ARN totales se extrajeron 72 h después de la infección usando Trizol (Ambion) y luego se purificaron usando el Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen). El extremo 5'cDNA de ptp2 se caracterizó utilizando el kit SMARTer® RACE 5'/3' según las recomendaciones del fabricante (Takara Bio). El paso de reacción de transcripción inversa (RT) se realizó con 1 ng de ARN total de células infectadas utilizando un cebador específico de ptp2c (5'-GTATGGATCCAATGTGGTTG-3') de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. 5'-RACE-PCR se realizó con el ciclador térmico ProFlex PCR System con los siguientes parámetros: 10 ciclos con un paso de desnaturalización de 30 s a 94 °C, 30 s de hibridación a 68 °C y un paso de elongación de 1,5 min a 72 °C. °C seguido de 30 ciclos con un paso de desnaturalización de 30 s a 94 °C, 30 s de recocido a 64 °C y un paso de elongación de 1,5 min a 72 °C seguido de un alargamiento final de 10 min a 72 °C. Los productos 5'-RACE-PCR se analizaron en gel de agarosa al 1%, se purificaron con el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen), se clonaron en pGEM®-T Easy (Promega) y se secuenciaron (Eurofins Genomics).

Se produjeron anticuerpos policlonales contra proteínas recombinantes expresadas por E. coli (PTP2, PTP3, PTP3b, PTP4, PTP5 y PTP7) en ratones CD1 a partir de bandas de proteínas purificadas separadas por SDS-PAGE (ver más abajo). También se produjeron antisueros policlonales contra bandas de 75 y 180 kDa de A. algerae aisladas de extracciones diferenciales de proteínas. Después de la tinción con azul de Coomassie, las bandas de proteínas se cortaron y trituraron en un tampón de elución (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,5). A los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal una muestra homogeneizada (vol/vol) con adyuvante completo de Freund (Sigma) para la primera inyección. Se realizaron inyecciones adicionales con muestra homogeneizada con adyuvante incompleto de Freund (vol/vol, Sigma) los días 14, 21, 28 y 35. Los sueros se recogieron 1 semana después de la última inyección y se almacenaron a -20 °C. Se produjeron anticuerpos contra PTP1 en conejos contra dos péptidos sintéticos ubicados en la parte N-terminal (CDEGGSPGSGKPSTLV, aa30-aa45) y la parte C-terminal (CEAPQNEGKTEEAPP, aa343-aa357) de la proteína (Eurogentec).

Se resuspendieron 109 esporas de A. algerae en 1 ml de una solución de germinación (NaHCO3-Na2CO3 0,2 M, pH 9,5) y se incubaron durante 2 h a 20 °C. Luego, las esporas germinadas se lavaron dos veces con 1 ml de PBS y se centrifugaron a 10.000 xg durante 2 min. El sedimento se resuspendió en PBS y los tubos polares se fragmentaron mediante sonicación durante 40 s a 60 Hertz. A continuación, 3 centrifugaciones sucesivas (2000×g 2 min) permitieron separar los tubos polares fragmentados (sobrenadante) y las esporas (pellet). El tercer sobrenadante se recogió, se centrifugó durante 10 min a 16.000 xg, se lavó con 1 ml de PBS y se centrifugó nuevamente a 16.000 xg durante 10 min para sedimentar los tubos polares fragmentados. La pureza de cada fracción se estimó mediante IFA utilizando anticuerpos dirigidos contra el tubo polar (anti-PTP3), como se describe en la sección IFA. La presencia de esporoplasmas en los tubos polares purificados se comprobó mediante tinción DAPI como se describe en la sección IFA. En cada condición se analizaron 10 campos y se contaron tanto las esporas germinadas como las esporas totales. Luego se calculó el porcentaje de esporas germinadas (consulte la Figura S4 complementaria y la Tabla S2). Las proteínas se extrajeron como se describe en la siguiente sección y se analizaron mediante SDS-PAGE y mediante transferencia Western utilizando anticuerpos anti-PTP pero también mediante espectrometría de masas.

Los extractos de proteínas totales de 109 esporas de A. algerae o fracciones de tubos polares purificadas se solubilizaron utilizando un tampón que contenía SDS al 2,5 % y DTT 100 mM. Las esporas o los tubos polares se rompieron en este tampón mediante 10 ciclos de congelación y descongelación en nitrógeno líquido seguidos de ebullición durante 15 minutos. Después de la centrifugación (14.000 xg durante 2 minutos), se recogieron las proteínas solubles totales (ET) en el sobrenadante. También se realizaron extracciones diferenciales de proteínas tratando esporas o tubos polares purificados con SDS al 2,5 % (extracto de SDS) y luego con un tampón de lisis que contenía SDS al 2,5 % y DTT 100 mM (extracto de DTT) o con SDS al 2,5 % y DTT 100 mM seguido de un tampón de lisis que contiene 2,5% de SDS-50% de 2-mercaptoetanol (2-ME). Las muestras de proteína de A. algerae se analizaron mediante SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 8%, 10% o 12%, según el peso molecular de las proteínas, y se tiñeron con azul de Coomassie. Para los estudios de inmunotransferencia, las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Merck Millipore). Después de bloquear durante 1 h en leche al 5% en PBS, las membranas se incubaron durante 3 h con antisueros de ratón o conejo diluidos a 1:200 en PBS-Triton X-100 al 0,1% seguido de 3 lavados en PBS-Triton X-100 al 0,1%. . Luego, las membranas se incubaron con una dilución 1:2500 de Ig G anti-ratón o anti-conejo de cabra conjugada con fosfatasa alcalina o conjugada con peroxidasa (H + L) (Promega) durante 1 hora a temperatura ambiente y se revelaron respectivamente con NBT/BCIP. sustratos o mezcla ECL y con sistema ChemiDoc (BioRad).

Los anticuerpos generados contra PTP recombinantes o proteínas de A. algerae se analizaron mediante ensayo de inmunofluorescencia indirecta en esporas germinadas. La germinación de esporas se estimuló en 107 esporas de A. algerae utilizando una solución de NaHCO3-Na2CO3 0,2 M, pH 9,5. Después de la incubación a 20 °C durante 2 h, se colocaron 50 µL de esporas germinadas en cubreobjetos de vidrio, se secaron durante la noche y se fijaron con metanol a -20 °C durante 20 min. Después de la fijación, los portaobjetos se saturaron con PBS-BSA al 1% y luego se incubaron a temperatura ambiente durante 3 h con anticuerpos diluidos a 1:100 en PBS-Triton X-100 al 0,1%. Después de 3 lavados en PBS-0,1% Triton X-100 durante 5 min, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo secundario diluido a 1:1000 en PBS-0,1% Triton X-100 durante 1 h (anti-ratón o anti-conejo Alexa Fluor 488 , Invitrogen). Después de 3 lavados en PBS-Triton X-100 al 0,1% y un lavado en PBS, los frotis se incubaron durante 5 min con DAPI (0,1 mg.L-1). Finalmente, los portaobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio con el soporte ProLong™ Diamond Antifade (Molecular Probes). Los portaobjetos se observaron bajo un microscopio de epifluorescencia Leica DM IRB y las imágenes se superpusieron con el software GIMP 2.10.8. Se observaron al menos 10 campos diferentes, lo que corresponde a ~ 50 a 130 esporas con su tubo polar extruido.

La preparación de bandas proteicas se realizó según Zhu et al.40. El extracto de péptidos ajustado exactamente a 30 µL con una solución de recuperación (H2O/ACN/TFA-94.95/5/0.05) se analizó mediante nano-LC-MS/MS usando un sistema Ultimate 3000 acoplado a un espectrómetro de masas QExactive HF-X ( Maestría, Thermo Fisher Scientific). Primero se preconcentró y desalinizó un µL de hidrolizado durante 6 minutos en una precolumna C18 (equilibrio de ácido trifluoroacético al 0,05 % en H2O; caudal de 30 µl/min) y luego se analizó en una columna C18 Acclaim PepMap 100 (equilibrio de 96 % de disolvente A ( 99,9% H2O, 0,1% ácido fórmico) - caudal 300 nl/min) con un gradiente de disolvente B (99,9% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico) de 5 a 32% en 50 min. Los péptidos eluidos se electropulverizaron a través de una fuente de iones de nanoelectropulverización en el espectrómetro de masas que funciona en modo dependiente de datos (DDA) de N superior. El procesamiento de datos sin procesar se llevó a cabo con el software Proteome Discoverer v1.4 y la búsqueda de iones MS/MS se realizó con Mascot v2.5.1 (http://www.matrixscience.com) en el banco de datos local Local_annc_alg base de datos39 con los siguientes parámetros: precursor tolerancia de masa de 10 ppm, tolerancia de masa de fragmentos de 0,05 Da, máximo de dos sitios de escisión omitidos de tripsina, carbamidometilación (C), oxidación (M) y desamidación (NQ) establecidos como modificaciones variables. La identificación de proteínas se validó cuando al menos dos péptidos procedentes de una proteína mostraron una identidad estadísticamente significativa por encima de las puntuaciones de Mascot > 21 con una tasa de descubrimiento falso del 2,4 % (umbral de significación predeterminado p < 0,05). La puntuación de iones es − 10 log(P), donde P es la probabilidad de que la coincidencia observada sea un evento aleatorio. A partir de la lista de proteínas identificadas, los dominios funcionales y los términos de ontología genética se determinaron con la herramienta InterPro 86.0 (//www.ebi.ac.uk/interpro/).

Los ARN totales se extrajeron de células HFF infectadas con A. algerae (72 h después de la infección). Los ARNm se retrotranscribieron con el kit de ARNm monocatenario Illumina TruSeq (Illumina), luego se unieron a adaptadores y se fijaron en la placa de la celda de flujo antes de la amplificación por PCR. Se realizó una secuenciación de Illumina de extremos emparejados (2 × 50 pb) con el secuenciador NovaSeq6000 (Illumina) (Fasteris). Se obtuvo un total de 1,7 × 109 lecturas. La calidad de las lecturas se controló con el software fastQC (Galaxy versión 0.72) y luego se mapearon las lecturas con el genoma humano (versión HG38 NCBI 18.05.21) con el software HISAT2 (Galaxy versión 2.1.0) para eliminar los ARNm correspondientes a las células huésped. Se realizaron dos ensamblajes de novo de las 252 × 106 lecturas restantes con Megahit (Galaxy versión 1.1.3.5; configuración predeterminada; multiplicidad mínima establecida en 2 para filtrado) y Trinity (Galaxy versión 2.8.4; configuración predeterminada (valor k = 25) y un mínimo de 2 K-mers). Se obtuvieron un total de 2793 y 4833 contigs con estos dos softwares, respectivamente. Utilizando estas dos secuencias establecidas como bases de datos, los genes que codifican las PTP se identificaron mediante un enfoque BLASTn local con un tamaño de palabra de 11 nucleótidos utilizando nuestras secuencias de ptp de A. algerae previamente identificadas como consultas.

El estudio se realizó de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes de ARRIVE. Los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las directivas francesas y europeas para el uso y cuidado de animales con fines de investigación y fueron aprobados por el “Comité d'Éthique pour l'Expérimentation Animale en Auvergne” (acuerdo de proyecto #2015120111273779).

Las secuencias contig ensambladas para A. algerae están disponibles en la base de datos de la Asamblea NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/) con el número de acceso GCA_000313815.1. Los números de acceso para los PTP completos de A. algerae son WAQ68434 (PTP1), WAQ68435 (PTP2), WAQ68436 (PTP3), WAQ68437 (PTP3b), WAQ68438 (PTP4), WAQ68439 (PTP5) y WAQ68440 (PTP7). Los datos sin procesar de RNA-seq de células HFF infectadas con A. algerae se enviaron al NCBI con el código de acceso SAMN32904311. Las secuencias completas de aminoácidos de proteínas identificadas mediante espectrometría de masas están disponibles en la Tabla complementaria S3. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE41 con el identificador de conjunto de datos PXD040773.

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Descargar referencias

Maurine Fayet recibió el apoyo de una subvención del "Ministère de l'éducation, de la recherche et de la technologie". Agradecemos a Mohamed Dorbani por su participación en el desarrollo del protocolo de purificación del tubo polar y a otros alumnos de LMGE por su participación en la implementación de varios experimentos. También agradecemos a G. Junion por el análisis de transferencia Western con el sistema ChemiDoc y a D. Viala y C Chambon por proporcionar el análisis de espectrometría de masas en PFEM cp protéomique (INRA Theix, Francia).

“Laboratorio “Microorganismos: genoma y medio ambiente”, CNRS, Universidad Clermont Auvergne, 63000, Clermont-Ferrand, Francia

Maurine Fayet, Nastasia Prybylski, Marie-Laure Collin, Eric Peyretaillade, Ivan Wawrzyniak, Abdel Belkorchia, Reginald Florian Akossi, Marie Diogon, Hicham El Alaoui, Valérie Polonais y Frédéric Delbac

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MF, VP y FD diseñaron los protocolos y enfoques científicos. MF, NP, IW, RFA y MLC llevaron a cabo los experimentos. MF, VP y FD escribieron el manuscrito. AB, EP, HEA y MD proporcionaron comentarios críticos. VP y FD supervisaron el proyecto. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Valérie Polonais o Frédéric Delbac.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Fayet, M., Prybylski, N., Collin, ML. et al. Identificación y localización de proteínas del tubo polar en el tubo polar extruido del microsporidio Anncaliia algerae. Representante científico 13, 8773 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35511-y

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Recibido: 23 de enero de 2023

Aceptado: 19 de mayo de 2023

Publicado: 30 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35511-y

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