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Jun 11, 2024

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Molecular Psychiatry volumen 27, páginas 4905–4917 (2022)Cite este artículo 3882 Accesos 1 Citas 16 Detalles de Altmetric Metrics La congelación es un comportamiento defensivo conservado que constituye un importante

Molecular Psychiatry volumen 27, páginas 4905–4917 (2022)Cite este artículo

3882 Accesos

1 Citas

16 altmétrica

Detalles de métricas

La congelación es un comportamiento defensivo conservado que constituye un importante mecanismo para afrontar el estrés. Décadas de investigación han demostrado el papel de la amígdala, la sustancia gris periacueductal y el hipotálamo como actuadores centrales del control de las respuestas de miedo, incluido el congelamiento. Sin embargo, se desconoce el papel que otros sitios moduladores desempeñan en este andamio cableado. Aquí, mostramos que la congelación provocada por la exposición a descargas eléctricas en los pies activa las neuronas GABAérgicas del tegmento laterodorsal (LDTg) que se proyectan al VTA, sin alterar la excitabilidad de las neuronas LDTg colinérgicas y glutamatérgicas. El silenciamiento quimiogenético selectivo de esta proyección inhibidora, pero no de otros subtipos neuronales de LDTg, amortigua las respuestas de congelación pero no previene la formación de recuerdos de miedo condicionados. Por el contrario, la activación optogenética de los terminales LDTg GABA dentro del VTA genera respuestas de congelación y provoca bradicardia, una característica común de la congelación. En particular, esta información aversiva se transmite posteriormente desde el VTA a la amígdala a través de una vía GABAérgica discreta. Por lo tanto, desvelamos un mecanismo de circuito que une las regiones LDTg-VTA-amígdala, que tiene una posible relevancia traslacional para estados patológicos de congelación, como trastornos de estrés postraumático, ataques de pánico y fobias sociales.

El estrés es un motor clave de adaptación. La respuesta al estrés es principalmente beneficiosa ya que promueve la supervivencia. Siempre que a un organismo vivo se le presenta un estímulo ambiental estresante, como una amenaza, se activan circuitos cerebrales dedicados para seleccionar la respuesta más adaptativa entre un repertorio diverso de conductas defensivas [1]. Estas respuestas innatas y aprendidas han sido moldeadas por la selección natural y conservadas tanto en invertebrados como en vertebrados. Las conductas defensivas varían según la naturaleza del estímulo, así como según factores internos como la inhibición conductual y los rasgos de ansiedad [2, 3]. En términos de resultados conductuales, los comportamientos defensivos varían desde estrategias pasivas como la congelación hasta respuestas activas de lucha o huida, y el cambio entre estos modos pasivos/activos es esencial para la flexibilidad conductual [1, 4, 5].

La congelación es una respuesta de miedo universal caracterizada por una falta total de movimiento, aparte de la respiración, debido a una postura corporal tensa cuando se encuentra una amenaza. La congelación es fundamental en los procesos de afrontamiento del estrés, ya que corresponde a un estado de hipervigilancia, que permite la toma de decisiones y, en consecuencia, la construcción de la estrategia conductual más pertinente. Aunque la congelación tiene relevancia para la etiología de los trastornos relacionados con amenazas, como los trastornos de estrés postraumático (TEPT), los ataques de pánico y las fobias sociales [6,7,8,9], los circuitos neuronales y los sustratos celulares subyacentes están lejos de comprenderse. . Una gran cantidad de evidencia indica que estructuras cerebrales como la sustancia gris periacueductal (PAG), el hipotálamo o el complejo amigdaloide desempeñan un papel importante en la detección, integración y respuesta a amenazas condicionadas y no condicionadas tanto en roedores como en humanos [2, 10 , 11]. De hecho, décadas de trabajo utilizando diferentes enfoques que van desde lesiones, intervenciones farmacológicas y estimulaciones eléctricas hasta herramientas opto y farmacogenéticas más recientes posicionaron a la amígdala como una unidad central en esta red jerárquica del sistema defensivo del miedo [11]. La amígdala lateral calcula información a partir de entradas sensoriales y asociativas de las cortezas y los núcleos talámicos que se transmite al núcleo de salida de la amígdala central [2, 11]. Este último influye en la actividad de PAG y las vías hipotalámicas para posteriormente influir en la actividad de la médula y la protuberancia, lo que produce cambios en la función de las vísceras, la contracción muscular y la sensibilidad al dolor [12]. Sin embargo, a la luz del impacto del estrés en el cerebro, es probable que el afrontamiento del estrés reclute redes cerebrales moduladoras clave, que podrían dar forma a las respuestas de congelación. Descubrir estas vías es un paso importante para comprender completamente la etiología de las respuestas de miedo, como la congelación, y para construir un mapa funcional integral de estas regiones subcorticales y corticales interconectadas subyacentes. En los seres humanos, esta red defensiva distribuida puede sufrir una activación indebida y desregulaciones persistentes sostenidas por cambios epigenéticos y sinápticos, que clínicamente se manifiestan como estados de angustia intensa, reacciones peritraumáticas y trastorno de estrés postraumático [13].

El núcleo tegmental laterodorsal (LDTg) está interconectado con regiones límbicas y responde a estímulos somatosensoriales, visuales y auditivos [14]. Aunque se estudió principalmente por su papel en las conductas orientadas a la recompensa [15,16,17] y el sueño paradójico [18, 19], trabajos recientes indican que el LDTg puede transmitir información relacionada con el estrés [20, 21]. El LDTg constituye un fuerte modulador del equilibrio motivacional que regula las conductas apetitivas y de valencia negativa. Como parte de la formación reticular, el LDTg también contribuye a la excitación conductual, facilitando así la integración sensorial [22, 23], que es un componente clave que afecta las respuestas de miedo. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el LDTg podría contribuir a comportamientos defensivos como las respuestas de congelación. Para probar esto, combinamos grabaciones electrofisiológicas in vivo y ex vivo y análisis de comportamiento para evaluar la congelación inducida por descargas eléctricas. Para vincular causalmente el LDTg con las respuestas de congelación, empleamos enfoques farmacogenéticos y optogenéticos en circuitos cerebrales etiquetados con virus. Descubrimos una vía no canónica que implica la proyección GABAérgica de LDTg al área tegmental ventral (VTA), que posteriormente impacta las neuronas amígdalas para regular las respuestas de congelación incondicionadas.

Todos los procedimientos se ajustaron a las recomendaciones de la Comisión Europea (2010/63/UE) para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité Ético Nacional Francés (#9185-2017020911476246 y #16459-2018061116303066). Utilizamos ratones macho C57BL/6J (Janvier Labs, Francia), ratones vGAT-CRE (The Jackson Laboratory, número de stock: 028862), ratones vGluT2-CRE [24] y ratones ChAT-CRE (The Jackson Laboratory, número de stock: 006410). Los ratones transgénicos eran heterocigotos y se retrocruzaron sobre un fondo C57BL/6J. Los ratones se alojaron de 4 a 5 ratones por jaula en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 ​​h con las luces encendidas de 8:00 am a 8:00 pm. Los ratones tenían libre acceso a comida y agua ad libitum. La vivienda enriquecida consistía en un bloque de madera para masticar, un iglú de plástico y algodón para facilitar la anidación. Todos los ratones utilizados en experimentos de comportamiento fueron manipulados diariamente durante 1 semana antes de cada prueba para limitar cualquier estrés inducido por inyecciones intraperitoneales y conexiones a cables láser para experimentos optogenéticos in vivo. Todas las pruebas se realizaron en ratones adultos que tenían al menos 2 meses de edad y se utilizaron compañeros de camada como controles. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas de ARRIVE.

El N-óxido de clozapina (CNO) se adquirió de Enzo Life (Francia), la ketamina y la xilazina de Centravet (Francia) y la picrotoxina de Sigma-Aldrich (Francia). Todos los fármacos para administración in vivo se diluyeron en solución salina de NaCl al 0,9%. Los ratones recibieron solución salina (10 ml/kg) o CNO (1 mg/kg) como se describió anteriormente en la ref. [20].

Los virus se adquirieron en las siguientes instalaciones: Addgene (plásmido n.° 50475 AAV8-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry, plásmido n.° 44362 AAV8-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry, plásmido n.° 44361 AAV8-hSyn-DIO-hM3D (Gq)-mCherry, plásmido #20298 AAV5-EF1a-doble floxed-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA, plásmido #20297 AAV5-EF1a-doble floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA) y Plateforme de vectorologie de Montpellier (Adenovirus canino tipo 2, CAV-2-Cre). Para la modulación de una manera específica de proyección y tipo de célula utilizamos virus de la instalación central de vectores de Zurich (identificador: v190-8 AAV-8/2-hSyn1-dFRT-hM4D(Gi)-mCherry(rev)-dFRT-WPRE- hGHp(A), identificador:v171-retrograde ssAAV-retro/2-hSyn1-chI-dlox-EGFP_2A_FLPo(rev)-dlox-WPRE-SV40p(A)), los títulos de AAV y CAV-2-Cre fueron ≥1012 ppl /mL y ≥1013 ppl/mL respectivamente.

Las inyecciones estereotáxicas se realizaron utilizando un marco estereotáxico (Kopf Instruments). La anestesia general se logró utilizando una mezcla de ketamina (150 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). Todos los virus se inyectaron bilateralmente a una velocidad de 100 nL/min para un volumen final de 200 nL por sitio (excepto VTA para el cual inyectamos 300 nL). Los ratones tenían entre 5 y 6 semanas de edad en el momento de la cirugía y se les dio al menos un período de recuperación de 3 semanas para experimentos farmacogenéticos y 6 semanas para pruebas optogenéticas para permitir una expresión viral suficiente. Las coordenadas estereotáxicas (anteroposterior: AP; Mediolateral: ML; dorsoventral: DV) se basaron en el atlas de Paxinos del cerebro de un ratón adulto [25] y se adaptaron a medida que realizábamos cirugías en ratones jóvenes. Se dan aquí en milímetros (mm) desde bregma para las coordenadas AP y ML, DV se toma del cráneo en el lugar de la inyección. Las coordenadas fueron las siguientes: LDTg: AP −4,70, ML ± 0,50, DV −3,60; VTA: AP −2,80, ML ± 0,60, DV −4,70; CeA: AP −0,75, ML ± 3,00, VD −5,05; vlPAG: AP −4,00, ML ± 0,60, DV −2,50; BLA: AP −1,30, ML ± 3,20, DV −4,60; LS: AP + 1,0, ML ± 0,2, VD −3,35.

Para silenciar las neuronas LDTg, se inyectó bilateralmente un AAV8-hSyn-hM4D (Gi) mCherry en el LDTg de ratones C57Bl6J.

Para silenciar específicamente las neuronas colinérgicas, glutamatérgicas y GABAérgicas LDTg, se inyectó bilateralmente un AAV8-hSyn-DIO-hM4D(Gi)mCherry en la LDTg de ratones ChATCre, vGluT2Cre y vGATCre, respectivamente.

Para el silenciamiento específico de la proyección, a ratones de tipo salvaje se les inyectó bilateralmente CAV-2-Cre en la sustancia gris periacueductal (PAG), la amígdala central (CeA) o VTA y con hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry en LDTg. (en adelante denominados ratones LDTghM4→PAG, LDTghM4→CeA, LDTghM4→VTA). Para la manipulación selectiva de las proyecciones VTAg → BLA, inyectamos bilateralmente un CAV-2-Cre en el BLA y un hSyn-DIO-hM4D (Gi) -mCherry en el VTA.

Para activar selectivamente LDTg a las proyecciones de VTA, inyectamos un CAV-2-Cre en el VTA y un hSyn-DIO-hM3D (Gq) -mCherry en el LDTg de ratones de tipo salvaje (en adelante denominado LDTghM3 → VTA).

Para la manipulación específica de la proyección y del neurotransmisor, a los ratones vGATCre se les inyectó bilateralmente un AAV-retro/2-hSyn1-chI-dlox-EGFP_2A_FLPo(rev)-dlox-WPRE-SV40p(A) retrógrado en el VTA y un AAV-8. /2-hSyn1-dFRT-hM4D(Gi)-mCherry(rev)-dFRT-WPRE-hGHp(A) en el LDTg (en adelante denominado GAThM4; LDTg→VTA).

Se implantaron fibras ópticas (núcleo de 200 μm, 0,39 NA, realizadas siguiendo el protocolo de [26] de forma bilateral en el VTA con un ángulo de 15° (AP: −2,8 mm; ML: −1,5 mm; DV: −4,2 mm), 4 –5 semanas después de la inyección viral. Las fibras ópticas se conectaron mediante una funda de acoplamiento (ThorLabs, ADAL1-5) a cables de conexión (Doric Lenses, MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25(F)) a una fibra óptica. junta giratoria (Doric Lenses FRJ_1x2i_FC-2FC_0.22) conectada a una fuente láser (ThorLabs S1FC473MM). Los ratones se habituaron a la conexión de fibra óptica durante 30 minutos por día durante la semana anterior a la prueba de comportamiento. El día del experimento, los ratones realizaron pruebas de comportamiento. pruebas después de 10 minutos [21] de habituación después de la conexión. La potencia del láser azul (470 nm) fue de 10 mW mm-2, medida en la punta de la fibra óptica. La estimulación luminosa se entregó a 50 Hz en pulsos de 20 ms durante períodos de 1 min. Los ratones del grupo de control se sometieron al mismo procedimiento y recibieron la misma intensidad de estimulación láser. Se excluyeron los ratones con inyecciones virales o implantes de fibra óptica mal colocados. Los parámetros de estimulación se basaron tanto en los registros electrofisiológicos ex vivo realizados en nuestro laboratorio como en la literatura publicada [21].

Para la prueba de aversión al lugar condicionada, utilizamos dos cámaras distintas (con diferentes señales visuales y táctiles) conectadas por un compartimento neutral. El día 1, los ratones control y vGAT-Cre ChR2 exploraron libremente el aparato durante 20 minutos. Del día 2 al 4, los ratones fueron asignados aleatoriamente a una cámara emparejada (el emparejamiento fue contrapesado) y recibieron estimulación luminosa (frecuencia de 50 Hz, duración de 20 ms, administrada a una duración de 5 minutos con intervalos de 5 minutos). Se realizaron dos sesiones de acondicionamiento de 20 minutos cada día, de modo que los ratones recibieron estimulación lumínica en la cámara emparejada y ninguna estimulación lumínica en la cámara no emparejada (sesiones am y pm contrapesadas). El día 5, los ratones exploraron libremente el aparato en ausencia de estimulación. Los resultados se expresan como diferentes entre el tiempo transcurrido en la cámara emparejada entre el día 5 (prueba) y el día 1 (prueba previa).

En todas las pruebas de comportamiento, a menos que se indique lo contrario, los ratones se alojaron en una sala de habituación adyacente a la sala experimental al menos 1 hora antes del comienzo de la prueba. A menos que se indique lo contrario, se inyectó solución salina o CNO 30 minutos antes de la prueba de comportamiento. Después de cada prueba, los ratones fueron alojados temporalmente en una nueva jaula para evitar la interacción social con ratones no probados hasta que todos fueron evaluados y finalmente regresaron a sus jaulas.

Para medir la congelación inducida por descargas eléctricas, cada ratón se colocó individualmente en una cámara de prueba insonorizada que contenía un piso hecho de una rejilla con 27 varillas de acero inoxidable (diámetro 4 mm) espaciadas 1 cm y conectadas a un generador para permitir la administración de descargas ( Shocker LE 100-26 Panlab Harvard Aparato Bioseb). Se dejó que los ratones exploraran libremente el aparato durante 3 minutos y luego recibieron tres descargas eléctricas consecutivas en los pies (intensidad: 0,7 mA, duración: 2 s) con un intervalo de 58 s entre cada descarga. Los ratones permanecieron en la cámara de prueba 1 minuto después de la última descarga en el pie. Los niveles de actividad de los ratones se registraron a través de una placa sensora de alta precisión colocada debajo de la rejilla del piso (acoplador de celda de carga LE 111 Panlab Harvard Apparatus Bioseb) para evaluar las variaciones de peso inducidas por los movimientos de los ratones. Cada prueba también se registró utilizando una cámara de vídeo (Samsung SDP-860) colocada encima del aparato. La congelación se definió como la falta total de movimiento aparte de la respiración durante una duración acumulada de al menos 2 s. Un experimentador ciego a las condiciones experimentales calificó manualmente el comportamiento de congelación de cada ratón utilizando las grabaciones de vídeo.

La versión subumbral del paradigma de congelación utilizado con el sistema activador hM3 DREADD se ejecutó durante 2 días. El primer día, los ratones se colocaron en la cámara de prueba como se describe anteriormente y se dejaron explorar libremente durante 5 minutos. El segundo día, los ratones recibieron una inyección de solución salina o CNO y se introdujeron inmediatamente en la cámara de prueba. Se dejó a los ratones 1 minuto para que exploraran libremente y luego recibieron dos descargas eléctricas en los pies (intensidad: 0,7 mA, duración: 2 s; intervalo de 58 s). Luego se dejó a los ratones tranquilos durante 15 minutos y se evaluó el comportamiento de congelación utilizando el mismo método descrito anteriormente durante los últimos 5 minutos de la prueba.

Todos los ratones empleados en la congelación y su versión subumbral no fueron reutilizados en otras pruebas de comportamiento.

Para manipulaciones optogenéticas in vivo, los ratones se colocaron en la misma caja de prueba y se dejaron libres para explorar el aparato durante 5 minutos (habituación, APAGADO). Luego, recibieron iluminación intracerebral durante 1 min (ON) y luego 1 min sin iluminación (OFF). No se aplicaron descargas eléctricas. Para probar la formación de recuerdos aversivos, los ratones fueron reexpuestos 24 h después al mismo contexto 24 h. La cámara de vídeo se colocó en un lateral de la cámara de pruebas para realizar más análisis de comportamiento.

Se utilizó la prueba O-maze para medir los niveles de ansiedad. Cada ratón se colocó en un laberinto circular que constaba de dos brazos abiertos y dos brazos cerrados que se alternaban en cuadrantes (ancho del carril para caminar: 5 cm, diámetro total: 55 cm, altura de las paredes: 12 cm, elevación sobre el suelo: 60 cm). ) con una luz ambiental de 200 lux en los brazos abiertos. Los movimientos de los ratones se registraron durante 5 minutos utilizando una cámara de vídeo colocada encima del laberinto. Un experimentador ciego a los grupos experimentales anotó el tiempo pasado en los brazos abiertos.

Se utilizó la prueba de campo abierto para medir la actividad locomotora. Cada ratón se colocó en un campo abierto de 40 × 40 cm con una luz ambiental de 200 lux durante 5 minutos y se dejó explorar libremente. Los movimientos de los ratones se registraron utilizando una cámara de vídeo colocada encima del aparato. Los viajes distanciados se analizaron automáticamente utilizando el software AnyMaze (Stoelting, Francia).

Se utilizó la prueba de Hargreaves para medir la sensibilidad al dolor. Cada ratón se colocó en un pequeño compartimento de plástico transparente en una habitación iluminada con luz roja durante 30 minutos de habituación. Luego, se colocó una fuente infrarroja radiante (intensidad: 190 ± 1 mW cm²) debajo de la pata trasera de los ratones y se midió la latencia para retirar la pata. Cada día, se tomaron dos medidas para cada pata trasera con al menos 1 minuto entre cada medida y se calculó la latencia media. La prueba se repitió durante 3 días con 1 día de intervalo entre cada prueba. Un experimentador ciego sólo analizó los resultados de los dos últimos ensayos. Es de destacar que los ratones que se sometieron a la prueba de Hargreaves se probaron primero en el laberinto O y luego en campo abierto con un intervalo de 4 días entre cada prueba para evitar el efecto potencial de la exposición previa a CNO.

Los ratones fueron anestesiados (ketamina 150 mg/kg, xilazina 10 mg/kg) y perfundidos transcardiacamente con aCSF para la preparación de cortes. Para los registros de LDTg, se obtuvieron cortes coronales de 250 µm en LCRa burbujeado enfriado con hielo (95% O2/5% CO2) que contenía (en mM): KCl 2,5, NaH2PO4 1,25, MgSO4 10, CaCl2 2,5, glucosa 11, sacarosa 234 y NaHCO3 26. Luego se incubaron las rodajas en LCRa que contenía (en mM): NaCl 119, KCl 2,5, NaHPO4 1,25, MgSO4 1,3, CaCl2 2,5, NaHCO3 26 y glucosa 11 a 37 °C durante 15 minutos, y luego se mantuvieron a temperatura ambiente. . Las rebanadas se transfirieron y se mantuvieron a 32–34 °C en una cámara de registro superfundida con 2,5 ml/min de aCSF. Se utilizaron técnicas de registro de pinza de voltaje o pinza de corriente visualizadas de células completas para medir las respuestas sinápticas o la excitabilidad, respectivamente, utilizando un microscopio vertical (Olympus Francia). Los experimentos de pinzamiento de corriente se obtuvieron utilizando un Multiclamp 700B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las señales se recogieron y almacenaron utilizando un convertidor Digidata 1440 A y el software pCLAMP 10.2 (Molecular Devices, CA). En todos los casos, la resistencia de acceso se controló en un paso de −10 mV (0,1 Hz) y los experimentos se descartaron si la resistencia aumentaba más del 20%. La solución interna contenía (en mM): KD-gluconato 135, NaCl 5, MgCl2, HEPES 10, EGTA 0,5, MgATP 2 y NaGTP 0,4. Se utilizaron pasos de corriente despolarizante (0–300 pA) o hiperpolarizante (0–450 pA) de 800 ms para evaluar la excitabilidad y las propiedades de la membrana de las neuronas LDTg y VTA. Para las grabaciones de VTA, se obtuvieron cortes horizontales de 250 µm como antes y se incubaron en aCSF durante 1 h a 37 °C antes de comenzar la grabación.

Para investigar las conexiones sinápticas funcionales dentro del VTA, inyectamos a ratones vGATCre un AAV-DIO-ChR2-YFP en el LDTg y un AAV-hSyn-DIO-mCherry en el VTA. Esto nos permite identificar neuronas VTA GABAérgicas que expresan mCherry mientras activan optogenéticamente las terminales GABAérgicas LDTg. En otro lote de ratones, realizamos las mismas inyecciones en LDTg y se identificaron supuestas neuronas VTA DA según criterios clásicos y como se hizo anteriormente [20, 27]. Para identificar inequívocamente las neuronas glutamatérgicas del VTA, inyectamos a ratones vGluT2Cre con AAV-hSyn-DIO-mCherry en el VTA y un AAV-hSyn-ChR2-YFP no dependiente de cre en el LDTg. Aislamos farmacológicamente el componente GABAérgico de la estimulación optogenética utilizando antagonistas del receptor glutamatérgico (AP5 50 μM y DNQX 10 μM) y antagonistas del receptor colinérgico (mecamilamina 10 μM y atropina 1 μM). Por último, para registrar las neuronas VTA → BLA, inyectamos a ratones vGATCre un AAV-DIO-ChR2-YFP en el LDTg y un retro AAV-hSyn-tdTomato en el BLA. Las secciones horizontales de VTA se prepararon como se hizo anteriormente [20]. Los registros de pinza de voltaje de células completas de neuronas marcadas con fluorescencia en VTA se realizaron utilizando la misma solución interna que antes con Vm = −40 mV en presencia de DNQX para bloquear las corrientes AMPA. Las fotocorrientes fueron inducidas por iluminación óptica (0,1 Hz) con pulsos de luz azul de 5 ms emitidos por un LED a través de la trayectoria de luz del objetivo. Se promediaron veinte barridos fuera de línea y se midió la amplitud máxima para evaluar el tamaño de la corriente evocada por la luz. Las corrientes mediadas por los receptores GABA-A se bloquearon utilizando un baño de picrotoxina (Sigma, Francia) aplicado a una concentración final de 50 µM.

En todos los casos, el análisis fuera de línea se realizó utilizando Clampfit 10.2 (Axon Instruments, EE. UU.) y Prism (Graphpad, EE. UU.).

Para lograr la fijación de los cerebros, los ratones fueron anestesiados usando una mezcla de ketamina (150 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) y luego se sometieron a perfusión transcardial con tampón fosfato frío (PB Na2HPO4/NaH2PO4 0,1 M, pH 7,4) seguido de paraformaldehído (PFA 4%, diluido en PB 0,1 M). Los cerebros se dejaron a 4 °C en PFA al 4% durante la noche y luego se cortaron en rodajas de 40 µm que flotaban libremente. Se utilizaron secciones para evaluar la ubicación correcta de la inyección viral estereotáxica para cada animal y la implantación de la cánula para experimentos optogenéticos in vivo.

Para el etiquetado con cFos, se incubaron secciones de cerebro que contenían el núcleo accumbens, la amígdala o el tabique lateral (30 min) en PBS-BT (PBS 0,5% BSA, 0,1% Triton X-100) con suero de cabra normal (NGS) al 10%. Luego, las secciones se incubaron (4 ° C) en PBS-BT, NGS al 1%, con anti-cFos primario (1:1000, Abcam anti-conejo 1:1000, Cat Ab190289) durante 36 h. Las secciones se enjuagaron en PBS y se incubaron (2 h) en anticuerpo secundario Alexa488 anti-conejo de cabra (1:1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA; anticuerpo secundario Alexa488 anti-conejo de cabra gato (1:1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA ; Cat. DI-1488-1.5) en PBS-BT, 1% NGS. Las secciones se enjuagaron con PBS y se incubaron 5 minutos con DAPI antes de montarlas con Mowiol. Las imágenes para la cuantificación de células positivas para cFos se adquirieron usando un microscopio confocal TCS SP5. (Leica Microsystems). Un experimentador ciego al tratamiento contó manualmente usando ImageJ. El conteo se realizó en dos secciones del cerebro adyacentes y los dos hemisferios para cada región analizada. Se promedió un valor medio para cada ratón y se representó gráficamente para cada condición experimental (es decir, Control o ChR2) como células cFos+/mm2.

Realizamos lo publicado anteriormente [28, 29]. Brevemente, las cirugías estereotáxicas para experimentos de electrofisiología se realizaron bajo anestesia con isoflurano al 1,0% y 1,5% (en 50% aire/50% O2; 1 l/min). Se introdujo una micropipeta de vidrio llena con una solución de pontamina azul cielo al 2 % en acetato de sodio al 0,5 % en el VTA (−3,16 mm/bregma, 0,5 mm/línea media, 3,5–4,5 mm/superficie del cerebro) [25]. Los potenciales extracelulares se registraron con un amplificador y filtro Axoclamp-2B (300 Hz/0,5 Hz) [30]. Los picos se recopilaron en línea (CED 1401, SPIKE 2; Cambridge Electronic Design; Reino Unido). Las neuronas de dopamina VTA se identificaron de acuerdo con características electrofisiológicas bien establecidas [31, 32], que incluían lo siguiente (i) un potencial de acción con ≥1,1 ms (medido desde el inicio del potencial de acción hasta el valle negativo), (ii) espontáneo tasa de disparo (≤10 Hz) (iii) patrones de disparo espontáneo único y en ráfaga compuestos por 2 a 10 picos in vivo. El inicio de una ráfaga se definió con un intervalo entre picos inferior a 80 ms y el final de la ráfaga con un intervalo entre picos superior a 160 ms [33]. Las supuestas neuronas VTA GABA se identificaron según criterios electrofisiológicos bien establecidos (i) un potencial de acción <1 ms; (ii) El límite del VTA se definió 100 µm dorsal a la primera neurona VTA DA [33,34,35,36]. Se analizaron varios parámetros para la activación y explosión de neuronas de dopamina VTA durante un período de 100 s: la distribución de probabilidad acumulada de la tasa de activación y los gráficos de barras con la media ± SEM, la tasa de explosión, el porcentaje de picos en ráfaga (% SIB). La frecuencia de activación de las neuronas GABA se analizó durante un período de 100 s. Los resultados se expresan como media ± SEM.

La frecuencia cardíaca se registró utilizando el oxímetro no invasivo MouseOx Pulse (Starr Life Sciences). Brevemente, los ratones se afeitaron alrededor del área del cuello 24 h antes de las grabaciones. El día de la grabación, se anestesiaron ratones individuales y se mantuvieron bajo una dosis de isoflurano de 1,0 a 1,5 % (en 50 % de aire/50 % de O2; 1 l/min). El collarín y el sistema se configuraron según las instrucciones del fabricante y se conectaron fibras ópticas a la cabeza para estimular los terminales LDTg GABA en el VTA. Después de obtener una línea base de 10 min, se administraron 3 protocolos de fotoestimulación a 50 Hz durante 1 min, separados por 2 min. La frecuencia cardíaca se adquirió a una frecuencia de muestreo de 5 Hz y se analizó mediante Excel. Las desviaciones de la frecuencia cardíaca con respecto al valor inicial se calcularon mediante la creación de una puntuación z de todo el trazo utilizando la media y la DE. Los datos se expresan como media ± SEM.

Los datos se analizaron utilizando Prism (GraphPad, EE. UU.). La normalidad de la distribución se probó por primera vez mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov. Dependiendo del número de grupos y de los resultados de la prueba de normalidad, los grupos se compararon utilizando una prueba t de Student, U de Mann-Whitney o análisis de varianza de dos vías seguidos de la prueba de Sidak post hoc. Los datos de las figuras se presentan como media ± SEM. La significación estadística se estableció convencionalmente en *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

Para evaluar la participación del LDTg en el procesamiento de la congelación, utilizamos un enfoque quimiogenético para silenciar de forma remota las neuronas LDTg antes de la administración de descargas eléctricas en los pies. Se inyectaron ratones C57BL / 6J de tipo salvaje en el LDTg con DREADD inhibidor (AAV-hSyn-hM4D-mCherry), en lo sucesivo denominados ratones LDTghM4 (Fig. 1a, panel izquierdo). Como se muestra en el gráfico de actividad, la aplicación de choque en el pie produjo una disminución en la actividad locomotora y un aumento del tiempo dedicado a posturas congeladas (Fig. 1a, panel central). La cuantificación del congelamiento en ratones tratados con solución salina mostró un aumento gradual en este comportamiento después de cada choque en el pie. Por el contrario, el silenciamiento de las neuronas LDTg generó un cambio pronunciado y significativo hacia abajo de la curva de respuesta de congelación (Fig. 1a, panel derecho). Esta reducción de la congelación no fue causada por cambios en la actividad locomotora, los niveles de ansiedad o la sensibilidad al dolor, ya que los ratones LDTghM4 tratados con solución salina y CNO mostraron respuestas similares en campo abierto, laberinto O elevado y prueba de Hargreaves (Fig. 1b, c, d respectivamente). Es importante destacar que la reducción de la congelación no afectó la formación de recuerdos aversivos, ya que la reexposición al mismo contexto 24 h después (día 2) produjo respuestas de congelación condicionada comparables en ambos grupos (Fig. S1). Estos resultados demuestran que la actividad en las neuronas LDTg es necesaria para la manifestación del congelamiento del miedo, pero no para la formación de la memoria de un evento aversivo.

a Panel izquierdo: a ratones de tipo salvaje se les inyectó AAV-hsyn-hM4-mCherry en el LDTg. La imagen de microscopía, a diferencia de la anatomía coronal de LDTg de la referencia [25], muestra fluorescencia roja en el lugar de inyección correcto. Tres semanas después, los ratones LDTghM4 recibieron una inyección de solución salina o CNO 30 minutos antes de la exposición a tres descargas eléctricas en las patas. Panel central: trazas representativas que muestran la actividad de los ratones durante la prueba. Panel derecho: las respuestas de congelación a las descargas eléctricas en los pies disminuyen en ratones tratados con CNO en comparación con solución salina. Los puntos representan el porcentaje medio ± SEM del tiempo dedicado a la congelación durante los siguientes intervalos de tiempo: 0 a 3 min, 3 a 4 min, 4 a 5 min y 5 a 6 min. Tratamiento de interacción × shocks F (3, 111) = 10,12; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación de Sidak, ***P < 0,001). b La actividad locomotora en campo abierto no se vio afectada por la inhibición de LDTg (P = 0,1072, prueba t). c Los niveles de ansiedad no se vieron afectados en la prueba O-maze (P = 0,3741, prueba t). d La sensibilidad al dolor no se vio afectada en la prueba de Hargreaves (P = 0,7339, prueba t). e A ratones de tipo salvaje se les inyectó AAV-hsyn-DIO-hM4-mCherry en LDTg y CAV-2-CRE en VTA. El silenciamiento quimiogenético de las proyecciones de LDTg a VTA reduce la congelación. Tratamiento de interacción × shocks F (3, 63) = 11,56; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación de Sidak, ***P < 0,001). f La hiperactivación de las proyecciones de LDTg a VTA aumenta la congelación. Las mismas inyecciones que “e”, excepto que hM4 (acoplado a Gi, inhibidor) fue reemplazado por hM3 (acoplado a Gq, excitador). Los ratones recibieron sólo dos descargas y su respuesta de congelación se midió 10 minutos después de la última descarga, durante 5 minutos. Porcentaje de tiempo que los ratones pasaron congelados (***P <0,001, prueba de Mann-Whitney).

Para desentrañar el circuito que vincula la LDTg y la congelación, llevamos manipulaciones quimiogenéticas específicas de las proyecciones de LDTg al gris periacueductal ventrolateral (vlPAG) y la amígdala central (CeA), dos regiones clásicamente vinculadas al control de las respuestas de congelación [11, 37 ]. Por lo tanto, inyectamos un CAV-2-Cre retrógrado en vlPAG o CeA y un DREADD inhibidor dependiente de Cre (AAV-hSyn-DIO-hM4D-mCherry) en LDTg para manipular de forma independiente las proyecciones LDTg → vlPAG o LDTg → CeA. Validamos este enfoque mediante inmunohistofluorescencia cuando observamos neuronas positivas para mCherry en LDTg y fibras rojas dentro de CeA y vlPAG (Fig. S2a, b respectivamente). El silenciamiento de las proyecciones LDTg → vlPAG o LDTg → CeA no alteró la respuesta de congelación que fue similar en ratones que recibieron solución salina o CNO (Fig. S2a, b respectivamente). A continuación, dado el creciente interés del VTA en el procesamiento de la aversión [38, 39] y las densas proyecciones que surgen del LDTg [40,41,42,43], planteamos la hipótesis de que esta vía podría estar implicada en las conductas de congelación. De hecho, el silenciamiento de las proyecciones LDTg → VTA desencadenó un cambio significativo hacia abajo en la respuesta de congelación (Fig. 1e), similar a los resultados obtenidos con el silenciamiento completo de LDTg (Fig. 1a). Dado este resultado, planteamos la hipótesis de que la activación de esta vía puede exacerbar las respuestas de miedo a un desafío aversivo leve. Por lo tanto, utilizamos DREADD excitador (AAV-hSyn-DIO-hM3D-mCherry) para estimular las proyecciones LDTg → VTA mientras exponíamos a los ratones a solo dos descargas en las patas. Los ratones inyectados con CNO mostraron una fuerte respuesta de congelación, lo que indica que un desafío de estrés leve preparó las proyecciones LDTg → VTA (Fig. 1f). Estos resultados apuntan a la especificidad de los circuitos LDTg discretos para el procesamiento aversivo de descargas eléctricas.

Para evaluar qué tipos de células LDTg están involucradas en la regulación de la respuesta de congelación, silenciamos individualmente cada población neuronal. Por lo tanto, inyectamos un AAV-hSyn-DIO-hM4-mCherry dependiente de Cre en líneas de ratones transgénicos vGlut2-Cre, ChAT-Cre o vGAT-Cre, lo que permite la manipulación selectiva de neuronas glutamato, colinérgicas o GABAérgicas, respectivamente. La respuesta de miedo inducida por descargas eléctricas en ratones LDTgGluT-hM4 y LDTgChAT-hM4 tratados con CNO fue comparable a la de los controles tratados con solución salina (Fig. 2a, b, respectivamente). En sorprendente contraste, la congelación se redujo notablemente en ratones LDTgGABA-hM4 inyectados con CNO (Fig. 2c, panel derecho), lo que señala un papel clave de la transmisión LDTg GABAérgica en las respuestas de congelación provocadas por descargas eléctricas.

a Silenciar las neuronas glutamatérgicas LDTg no altera la congelación. Los ratones vGluT2-cre recibieron una inyección de AAV-hsyn-DIO-hM4-mCherry en LDTg y luego se sometieron a un paradigma de congelación; La imagen de microscopía muestra la expresión de mCherry en el lugar de la inyección. Porcentaje de tiempo que los ratones pasaron congelados en cada intervalo, igual que en la Fig. 1 (tratamiento de interacción × descargas F (3, 78) = 0,4895; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación de Sidak, P = 0,6906). b El silenciamiento de las neuronas colinérgicas LDTg no altera la congelación. Igual que el anterior, excepto que los ratones eran ChAT-cre (tratamiento de interacción × descargas F (3, 87) = 0,4895; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación de Sidak, P = 0,6117). c Silenciar las neuronas GABAérgicas LDTg reduce la congelación. Igual que el anterior, excepto que los ratones eran vGAT-cre (tratamiento de interacción × descargas F (3, 114) = 5,646; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación de Sidak, **P <0,01; ***P <0,001).

Los resultados anteriores mostraron que el silenciamiento independiente de las neuronas GABAérgicas LDTg o de las proyecciones LDTg → VTA es suficiente para amortiguar la respuesta de congelación provocada. Para probar si las neuronas LDTg GABA que se proyectan al VTA pueden ser clave en este proceso, a continuación manipulamos el LDTg de una manera específica para el neurotransmisor y la proyección utilizando una estrategia de doble intersección. Primero inyectamos en el VTA de ratones vGAT-Cre un AAV-DIO-flp retrógrado que permite la expresión de la flippasa (flp) de manera dependiente de Cre (es decir, en neuronas GABAérgicas LDTg → VTA). A continuación, se inyectó un DREADD inhibidor dependiente de flippasa (AAV-hSyn-FRT-hM4-mCherry) en el LDTg. Mientras que los ratones LDTgGABA → VTA-hM4 tratados con solución salina mostraron una respuesta de congelación normal, los ratones tratados con CNO demostraron un desplazamiento descendente significativo de la curva de congelación (Fig. 3a). Esto proporciona una fuerte evidencia del papel regulador clave de esta proyección GABAérgica sobre la respuesta al miedo.

a Silenciar las proyecciones de LDTg GABAérgico a VTA reduce la congelación. Panel izquierdo: los ratones vGAT-cre recibieron inyecciones de AAV-hsyn-FRT-hM4-mCherry en LDTg y DIO-flp retrógrado en VTA y luego siguieron el mismo protocolo que en la Fig. 1: las imágenes de microscopía muestran cuerpos celulares que expresan mCherry (sitio de inyección) y fibras en VTA. Panel central: trazas representativas que muestran la actividad de los ratones durante la prueba. Panel derecho: porcentaje de tiempo que los ratones pasaron congelados en cada intervalo. Interacción tratamiento × shocks F (3, 90) = 3,088; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación de Sidak, **P < 0,01). b Las proyecciones GABAérgicas de LDTg a VTA están sensibilizadas por estrés agudo. Panel izquierdo: a los ratones vGAT-cre se les inyectó AAV-FLEX-tdTomato retrógrado en VTA y luego recibieron 3 descargas (estresados) o ninguna descarga (ingenuo). Panel central izquierdo: imágenes de microscopía de células GABAérgicas que se proyectan a VTA en LDTg con luz de transmisión (arriba) o emitiendo fluorescencia roja (abajo). Panel central derecho: el voltaje representativo rastrea las respuestas a una inyección de corriente de 40 pA para cada condición. Panel derecho: perfil de excitabilidad de las neuronas LDTg GABAérgicas que se proyectan a VTA en ratones control o estresados. Los gráficos representan la frecuencia del potencial de acción después de aumentar los pasos de inyección actuales. Tratamiento de interacción × F actual (4, 144) = 1,866); Factor de tratamiento F (1, 36) = 5,082; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación de Sidak, *P < 0,05).

¿Puede la exposición a golpes aversivos en los pies alterar las propiedades celulares de las neuronas LDTg → VTA GABAérgicas para promover respuestas de miedo? Realizamos grabaciones ex vivo de parches de células enteras en neuronas GABAérgicas LDTg → VTA marcadas con virus. Para ello, a ratones vGAT-Cre se les inyectó en el VTA un AAV-FLEX-tdTomato retrógrado (Fig. 3b). Los ratones fueron sometidos a 3 descargas eléctricas consecutivas en las patas como se describe para la prueba de comportamiento y se registraron inmediatamente después. Los ratones de control fueron expuestos a la cámara sin recibir descargas en las patas. La exposición a descargas en los pies desencadenó una mayor excitabilidad de las neuronas GABAérgicas LDTg → VTA, evidenciada por una mayor frecuencia de descarga de las inyecciones de corriente despolarizante en comparación con ratones sin descargas (Fig. 3b, panel derecho). Es importante destacar que esta adaptación no estuvo acompañada de ningún efecto significativo sobre las propiedades pasivas de la membrana de la célula, como la resistencia de la membrana, la capacitancia de la membrana o el potencial de la membrana en reposo (Fig. S3a, b, c). Para probar si las descargas eléctricas podrían alterar la actividad de otros tipos de células LDTg, aplicamos el mismo procedimiento a ratones ChAT-Cre y vGluT2-Cre y registramos neuronas colinérgicas y glutamatérgicas LDTg → VTA. En contraste con lo que observamos para la proyección de neuronas LDTg GABA, las descargas eléctricas no lograron modificar el perfil de excitabilidad de las neuronas colinérgicas y glutamatérgicas que se proyectan al VTA (Figura complementaria 5a). Sin embargo, las neuronas GABAérgicas LDTg proyectadas no solo se dirigen al VTA. Por lo tanto, la última vez que probamos si las descargas eléctricas podrían alterar la función de las neuronas GABAérgicas independientemente de las regiones cerebrales objetivo. Para ello, a ratones vGATCre se les inyectó en el vlPAG un AAV-FLEX-tdTomato retrógrado. Mientras que encontramos una mayor sensibilidad de las neuronas GABAérgicas LDTg → VTA, el perfil de excitabilidad de las neuronas GABAérgicas LDTg → vlPAG permaneció inalterado (Figura complementaria 5b). Por tanto, los impactos en los pies afectan la actividad de una vía discreta de LDTg GABAérgica.

Nuestros datos recopilados hasta ahora indican que las descargas eléctricas desencadenan la congelación al preparar las neuronas LDTg GABAérgicas LDTg → VTA. Para probar si se podía inducir la congelación sin una experiencia aversiva, empleamos estimulación optogenética selectiva en ratones que se comportaban libremente. Inyectamos un AAV-hsyn-DIO-hChR2-YFP dependiente de Cre en el LDTg de ratones vGAT-Cre e implantamos fibras ópticas bilateralmente por encima del VTA. La estimulación luminosa de ChR2 expresada en las terminales LDTg GABAérgicas en el VTA fue suficiente para inducir una congelación significativa en ausencia de cualquier estímulo aversivo (Fig. 4a). Los ratones dejaron de congelarse una vez que se apagó la estimulación, lo que indica un proceso celular dinámico. Es importante destacar que cuando los ratones se volvieron a exponer al mismo contexto 24 h después, en ausencia de estimulación luminosa, no se observó congelación condicionada (Figura complementaria S6a). Además, evaluamos si combinar la estimulación luminosa en un contexto definido podría desencadenar una aversión condicionada al lugar. Se realizaron tres emparejamientos diarios y se probaron los ratones en ausencia de estimulación lumínica. Es de destacar que la distancia recorrida por los ratones ChR2 en la cámara no emparejada fue mayor que en la cámara emparejada como se esperaba, donde la estimulación luminosa indujo inmovilidad (Figura complementaria 6b). Sin embargo, tanto los ratones de control como los ChR2 pasaron una cantidad de tiempo similar en la cámara emparejada durante las sesiones previas a la prueba y de prueba (Fig. 4b). Esto indica que la activación de los terminales LDTg GABAérgicos en el VTA no produce recuerdos aversivos.

a La activación optogenética in vivo de los terminales GABAérgicos LDTg dentro del VTA induce la congelación espontánea. Panel izquierdo: a los ratones vGAT-cre se les inyectó AAV-hsyn-DIO-hChR2-YFP (ChR2) o AAV-hsyn-DIO-YFP (control) en LDTg y se les implantaron fibras ópticas por encima del VTA; Las imágenes de microscopía muestran fluorescencia verde en el lugar de la inyección y expresión de YFP en el lugar de la inyección y fibras que expresan YFP con rastros de fibras ópticas en el sitio de implantación en el VTA. Panel central: línea de tiempo experimental. Panel derecho: porcentaje de tiempo que los ratones pasaron congelados representado como media ± SEM en los siguientes intervalos (grupo de interacción × luz F (2, 30) = 4,166; medidas repetidas ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación de Sidak, ***P < 0,001 ). b Los ratones control y ChR2 recibieron estimulación luminosa en el compartimento emparejado y ninguna estimulación luminosa en el lado no emparejado. Después de 3 emparejamientos en cada lado, se permitió que los ratones exploraran libremente el aparato de acondicionamiento. La activación optogenética in vivo de las terminales GABAérgicas LDTg no logró inducir aversión al lugar (t31 = 0,1606, P = 0,8735). c Utilizando la monitorización telemétrica de la frecuencia cardíaca en ratones anestesiados, la estimulación luminosa en ratones ChR2 provocó bradicardia que no se observó en los animales de control cuando se encendió el láser (t7 = 1,128, P = 0,2966 control; t12 = 5,191, P < 0,001 ChR2).

Para diferenciar si la estimulación optogenética provocó una congelación incondicionada o simplemente un paro motor, realizamos mediciones telemétricas de la frecuencia cardíaca. Esto se hizo en ratones anestesiados para evitar cambios confusos en la función cardíaca y la actividad física. La estimulación luminosa en ratones ChR2 provocó una desaceleración significativa de la frecuencia cardíaca (es decir, bradicardia), que no se observó en los ratones de control (Fig. 4c). En general, este experimento optogenético imita dos características de la congelación incondicionada: la inmovilidad y la bradicardia. Sin embargo, dado que esta intervención no desencadena recuerdos de miedo y que la congelación es la suma de diferentes respuestas fisiológicas, incluida la actividad motora detenida, especulamos que este reclutamiento de circuito artificial puede no recapitular completamente las respuestas emocionales a estímulos amenazantes.

Aunque algunos estudios implicaron al VTA en la formación de respuestas de congelación condicionada [44, 45], se desconoce su papel en la congelación inmediata incondicionada de una amenaza, así como sus objetivos de producción. Para comprender los circuitos que median la respuesta de congelación de LDTg GABA, utilizamos estimulación optogenética de fibras LDTg GABA sobre el VTA como antes, y los ratones se sacrificaron 90 minutos después de la estimulación luminosa para realizar un mapeo cerebral de la expresión de cFos (Fig. 5a). Hemos reducido nuestros análisis a dos estructuras cerebrales que se sabe que desempeñan funciones importantes en la congelación: la amígdala [11] y el tabique lateral [46]. Como objetivo principal del VTA y considerando su papel en las respuestas motoras, también analizamos la reactividad del núcleo accumbens (NAc). La activación de los terminales LDTg GABA dentro del VTA provocó una activación sorprendente tanto en la amígdala como en el tabique lateral, pero no en la NAc (Fig. 5b, cy Fig. complementaria 7a, b respectivamente).

a Los ratones Control y vGAT-Cre ChR2 se sacrificaron 90 minutos después de la estimulación luminosa como se muestra en la línea de tiempo experimental (panel izquierdo). Las neuronas positivas para cFos se contaron en (b) la amígdala basolateral y central (BLA y CeA respectivamente), (c) la parte dorsal y ventral del tabique lateral (LSD y LSV respectivamente). d En ratones WT, el silenciamiento quimiogenético de las proyecciones de VTA al BLA (tratamiento de interacción × descargas F (3, 51) = 3,604; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación de Sidak, **P <0,01), reduce la congelación. e El silenciamiento quimiogenético de las proyecciones de VTA al LS no modifica el comportamiento de congelación (tratamiento de interacción × descargas F (3, 66) = 0,3606; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación de Sidak, P = 0,7817). *P < 0,05; **P<0,01.

A la luz de estos resultados, a continuación probamos si la modulación de las proyecciones VTA → BLA o VTA → LS afectaría las respuestas de congelación. Utilizando una estrategia viral interseccional, expresamos un DREADD inhibidor en neuronas VTA → BLA (Fig. 5d) o en VTA → LS (Fig. 5e) y expusimos ratones a descargas eléctricas en las patas. Solo se observó una disminución significativa en la congelación al silenciar las proyecciones VTA → BLA pero no la vía VTA → LS (Fig. 5d, e respectivamente). Estos resultados apuntan a la especificidad de objetivos VTA discretos en la respuesta de congelación.

¿Las neuronas LDTg GABAérgicas modulan directamente las neuronas proyectantes VTA → BLA o invaden los microcircuitos VTA? Para probar esta hipótesis, investigamos la conectividad funcional entre esta entrada inhibidora de LDTg y los tres tipos de células VTA (es decir, neuronas GABA, DA y Glu), así como las neuronas proyectantes de VTA como se describe en Métodos. Después de la fotoestimulación de las terminales LDTg, encontramos el 24% de las células (7/29) conectadas con neuronas proyectantes VTA → BLA (Figura complementaria 8a). En sorprendente contraste, el 91% de las células VTA GABA (20/22) recibieron entradas de GABA del LDTg (Figura complementaria 8b). Estas corrientes de salida fueron bloqueadas por la picrotoxina, lo que indica que esta respuesta se produjo a través de los receptores GABA-A (Figura complementaria 8f). Además, las neuronas GABAérgicas LDTg hicieron contactos funcionales con el 95% de las neuronas VTA DA (19/20). En cambio, solo el 33% de las neuronas VTA Glu (7/21) recibieron entradas de GABA del LDTg (Figura complementaria 6d). Entre las células conectadas, la amplitud de las corrientes postsinápticas inhibidoras ópticas (oIPSC) fue mayor en las neuronas VTA GABA y DA en comparación con las células VTA Glu o las neuronas proyectantes VTA → BLA (Figura complementaria 6e). Este primer conjunto de datos indica una conectividad funcional más pronunciada con los microcircuitos VTA que con los proyectantes, con preferencia por las neuronas DA y GABA VTA.

Los resultados del análisis de conectividad sugieren que el silenciamiento de las neuronas GABAérgicas LDTg→VTA debería modular preferentemente la actividad de las neuronas VTA GABAérgicas o DA. Para probar esta posibilidad y tener una visión más completa del control de LDTg sobre la función VTA, realizamos grabaciones in vivo en animales anestesiados mientras silenciamos las proyecciones GABAérgicas de LDTg → VTA (Fig. 6a). En ratones tratados con solución salina, las supuestas neuronas GABAérgicas VTA exhibieron un patrón de actividad de activación clásico (Fig. 6b) similar a informes anteriores [34, 35, 36]. Por el contrario, los ratones tratados con CNO mostraron un fuerte desplazamiento hacia la izquierda en la distribución de la velocidad de activación de las supuestas neuronas VTA GABA, lo que refleja una marcada disminución de la actividad (Fig. 6b). Para determinar si el silenciamiento de la vía GABAérgica LDTg → VTA tuvo un impacto más amplio en la homeostasis de VTA, también registramos in vivo la actividad de las neuronas VTA DA. La distribución de la tasa de activación (Fig. 6c), la actividad de explosión y los cuatro modos principales de patrones de activación de las neuronas VTA DA [47] no difirieron entre los grupos tratados con solución salina y con CNO (Figura complementaria 9).

a Se realizaron grabaciones in vivo en el VTA de ratones LDTgGABA → VTA-hM4 anestesiados y se analizó la actividad de las supuestas neuronas VTA GABA o DA tras la administración sistémica de solución salina o CNO. La distribución de probabilidad acumulada de la tasa de activación, así como la frecuencia de activación (recuadro) se presentan para las supuestas neuronas VTA GABA (b) y VTA DA (c). Se presentan trazas representativas para cada condición experimental. El silenciamiento de las entradas de LDTg GABAérgicas a VTA disminuye selectivamente la actividad de las neuronas VTA GABA sin alterar la activación de VTA DA. **P < 0,01 Prueba de Mann-Whitney. Los ratones d vGATCre recibieron una inyección de AAV-hSyn-FRT-hM4-mCherry en el VTA y retro AAV-DIO-Flp en el BLA, y luego se sometieron a un paradigma de congelación. La imagen de microscopía muestra la expresión de mCherry en el lugar de la inyección de VTA. El silenciamiento selectivo de las neuronas GABAérgicas VTA→BLA disminuyó las respuestas de congelación (tratamiento de interacción × descargas F (3, 45) = 4,947; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba de comparación de Sidak, **P < 0,01.

Las neuronas VTA GABA pueden ser neuronas de largo alcance o podrían modular la función VTA a través de la conectividad local [34, 35, 48,49,50]. Para intentar resolver este problema, intentamos identificar la naturaleza del neurotransmisor que transmite información relacionada con la congelación a la amígdala. Por lo tanto, silenciamos de una manera específica de proyección y neurotransmisor las neuronas DA, Glu y GABA VTA → BLA mientras sometíamos a los ratones a descargas eléctricas en los pies para provocar la congelación. Solo el silenciamiento de las neuronas GABAérgicas VTA → BLA, pero no de DA o Glu, disminuyó la congelación (Fig. 6d, Fig. Suplementaria 10a, b, respectivamente).

En general, este conjunto de datos vincula una entrada inhibidora del LDTg a la función VTA GABA y proporciona evidencia de una respuesta coordinada del macrocircuito LDTg-VTA-amígdala durante el procesamiento aversivo (Figura complementaria 11).

Si bien se han identificado muchas regiones del cerebro que apoyan las respuestas de congelación, se desconoce el papel que los sitios moduladores desempeñan en esta estructura cableada. Nuestros resultados proporcionan un marco novedoso para comprender cómo las experiencias aversivas desencadenan rápidos cambios celulares que, en última instancia, conducen a comportamientos defensivos. Aquí mostramos que la actividad de las entradas LDTg GABAérgicas al VTA es necesaria para la manifestación de comportamientos de congelación en respuesta a un peligro inminente. La estimulación optogenética de esta proyección es suficiente para promover la congelación en ausencia de amenaza y reclutamiento de sustratos de la amígdala. Nuestro estudio demuestra un papel descubierto de esta vía en los comportamientos defensivos adaptativos ante la amenaza, lo que proporciona conocimientos novedosos sobre los circuitos de afrontamiento del estrés.

La red defensiva del cerebro incluye varias áreas corticales y subcorticales interconectadas que son esenciales para la detección y el procesamiento de amenazas con el fin de impulsar respuestas defensivas oportunas [37, 51, 52]. Los estudios de imágenes funcionales en humanos y disecciones moleculares, celulares y de circuitos ampliadas en roedores posicionaron la amígdala, la corteza gris periacueductal y la corteza prefrontal como actuadores centrales del control de las respuestas de miedo, que incluyen el congelamiento. Si bien una gran cantidad de evidencia proporciona una base sólida para los macrocircuitos y circuitos locales que gobiernan las respuestas de congelación condicionada [11], todavía falta una comprensión detallada de los mecanismos celulares y la secuencia de eventos que provocan el comportamiento de congelación incondicionada. Esto es muy relevante ya que los síntomas y la patogénesis de los trastornos relacionados con amenazas dependen de respuestas de miedo tanto aprendidas como innatas [10, 53]. En nuestro estudio demostramos que las descargas eléctricas en los pies desencadenan un aumento inmediato en la excitabilidad de las neuronas inhibidoras de proyección de LDTg al VTA. El silenciamiento de esta proyección específica tiene un impacto selectivo sobre la función de las neuronas VTA GABAérgicas, sin alterar la activación de las células VTA DA. Además, analizamos las salidas de VTA y observamos que el silenciamiento de las proyecciones VTA GABAérgicas a la amígdala amortigua las respuestas de congelación incondicionadas a los golpes en los pies. En un estudio reciente, la inhibición optogenética selectiva de las terminales VTA DA en la amígdala perjudicó la adquisición de recuerdos aversivos, pero no afectó la congelación incondicionada de los golpes en los pies [54]. Esto sugiere que diferentes poblaciones de neurotransmisores de VTA a la amígdala contribuyen a la congelación condicionada y no condicionada.

Respaldando el papel del VTA en las respuestas defensivas, dos informes recientes vincularon el VTA GABA y las neuronas glutamatérgicas con un comportamiento defensivo innato [48, 55]. De hecho, la exposición al olor de los depredadores o a un estímulo inminente provocó una activación transitoria de las neuronas de glutamato VTA asociadas con conductas de escape [55]. Además, la aparición de conductas de escape evocadas en ciernes se correlacionaron con transitorios de Ca2+ en las neuronas VTA GABA [48]. De acuerdo con nuestro estudio, los autores informaron que la estimulación optogenética directa de esta población neuronal global produjo una congelación seguida de un comportamiento de huida al nido. Esto revela claramente un papel emergente del VTA en los comportamientos defensivos de escape. Sin embargo, aunque se ha demostrado que las neuronas VTA reaccionan a los golpes en los pies [34], su participación en la provocación de respuestas rápidas de miedo sigue sin descubrirse. Aquí, ampliamos el papel de VTA en las respuestas defensivas al mostrar el desencadenamiento de la congelación modulando únicamente una entrada de GABA de la región pontina. Los estudios que abordan el papel del VTA en la valencia positiva y negativa se han centrado con diferencia en el papel de las neuronas VTA DA. Aquí, en los experimentos que llevamos a cabo, no pudimos implicar a esta población neuronal, pero sin embargo, identificamos un papel para las neuronas VTA GABAérgicas de largo alcance. Esto sugiere que, de manera similar a las neuronas VTA DA, es probable que las neuronas GABAérgicas de largo alcance aparezcan, al menos en parte, como una población neuronal segregada que computa distintos estímulos ambientales y demandas internas, con el fin de impulsar diferentes facetas de respuestas conductuales que van desde la modulación de la morfina. propiedades gratificantes, hasta aprendizaje asociativo y congelación incondicionada (presente estudio) [49, 56, 57].

En general, en estos macro y microcircuitos de comportamientos defensivos cerebrales que revelamos, un modelo putativo sería que las descargas eléctricas activen las neuronas GABAérgicas LDTg para producir la desinhibición de las neuronas VTA→BLA mediante la modulación de las neuronas VTA locales, supuestamente GABA [50]. .

Para navegar en entornos complejos y en rápida evolución, los mamíferos deben adaptar sus comportamientos para obtener acceso a recursos vitales y al mismo tiempo evitar situaciones dañinas. Estas respuestas conductuales están finamente sintonizadas por adaptaciones celulares rápidas y duraderas cuando se enfrentan desafíos gratificantes y/o aversivos [58]. La desregulación de este equilibrio homeostático conduce a elecciones inapropiadas y aumenta el riesgo de desarrollar enfermedades psiquiátricas [59]. Históricamente, el eje LDTg-VTA ha estado fuertemente vinculado con el procesamiento y el refuerzo de recompensas [60, 61]. El LDTg es un modulador importante de la actividad de activación de dopamina del VTA y, en consecuencia, de la liberación de dopamina en el prosencéfalo [20, 62, 63]. Los estudios farmacológicos y de lesiones han destacado su papel clave en la atribución de valor de recompensa a los estímulos y en la mediación de varias adaptaciones celulares y conductuales a sustancias adictivas como la cocaína y la nicotina [64]. Las manipulaciones específicas de la proyección revelaron su contribución a conductas gratificantes y motivadas por el apetito [16, 43], con una clara contribución de las proyecciones colinérgicas y glutamatérgicas de LDTg a estos procesos [42]. De hecho, la estimulación optogenética selectiva en el VTA de las terminales glutamatérgicas o colinérgicas de LDTg es gratificante, lo que se refleja en la cantidad de tiempo invertido y las entradas a una cámara de estímulos emparejados [42]. La evidencia reciente apunta a una participación parcial de las entradas GABAérgicas al VTA en el restablecimiento de las conductas de búsqueda de cocaína [65]. A pesar de estas pruebas sólidas de la participación del eje LDTg-VTA en el procesamiento de estímulos positivos, nuestro presente trabajo cuestiona esta visión aceptada y demuestra una implicación causal de las entradas inhibidoras de LDTg al VTA en el procesamiento de desafíos aversivos inmediatos. Nuestros resultados están respaldados por evidencia que muestra que la manipulación optogenética de las interneuronas LDTg locales impacta el miedo innato inducido por señales olfativas [21]. Es probable que esto afecte las salidas de LDTg y module la actividad objetivo aguas abajo, incluido el eje LDTg-VTA identificado aquí. Además, nuestro trabajo anterior demostró que la sobreactivación de las entradas colinérgicas de LDTg a las neuronas de dopamina VTA después de una agresión social desencadenaba la aparición de síntomas similares a los depresivos [20]. Más recientemente, se ha demostrado que una molécula trófica derivada de neuronas, la neuregulina-1, aumenta en el LDTg después del estrés por derrota social crónica y promueve comportamientos similares a los depresivos al afectar la actividad de las neuronas VTA DA [66]. Por último, la exposición in útero a las hormonas del estrés, los glucocorticoides, induce déficits motivacionales, que pueden contrarrestarse modulando las proyecciones de LDTg-VTA [67]. En conjunto, esto sugiere que los estímulos ambientales destacados, ya sean gratificantes o aversivos, reclutarían poblaciones independientes de neuronas LDTg, y que la polarización temprana de las redes positivas y negativas fue una simplificación excesiva [68]. Por lo tanto, las neuronas LDTg colinérgicas/glutamatérgicas y GABAérgicas podrían codificar estados motivacionales complementarios, promoviendo el acercamiento o la defensa, respectivamente, a través de proyecciones al VTA. Las respuestas de aproximación y defensa requieren la participación coordinada de los centros motores. En particular, el núcleo pedunculopontino (PPN), un centro estrechamente relacionado en el tronco del encéfalo, envía proyecciones ascendentes a la mayoría de los núcleos de los ganglios basales, en particular a la sustancia negra (SN), controlando las respuestas motoras [23]. Por ejemplo, la activación optogenética de las terminales colinérgicas de PPN dentro del SN aumenta la locomoción [17]. Un informe reciente de bioRxiv muestra que las neuronas GABAérgicas PPN hacen sinapsis con las neuronas SN DA y que su activación altera la locomoción exploratoria y detiene el inicio del movimiento, pero no produce respuestas de congelación [69]. En general, es probable que las distintas proyecciones GABAérgicas de LDTg y PPN a VTA y SN, respectivamente, transmitan señales complementarias que impulsen el miedo y las respuestas motoras. Se necesitan trabajos futuros para comprender el papel potencial de la vía PPN → SN GABAérgica en respuesta a estímulos aversivos, como golpes en los pies, y una supuesta interferencia entre estas proyecciones paralelas del tronco encefálico.

Descubrir regiones moduladoras como la que se describe aquí es fundamental para comprender las respuestas naturales a los estímulos amenazantes. Es importante destacar que la vía identificada aquí se limitó a la inducción de congelación incondicionada y no produjo la formación de recuerdos aversivos. Además, comprender las adaptaciones sinápticas y celulares en estos circuitos podría ayudarnos a comprender los mecanismos subyacentes que contribuyen a los síntomas de condiciones patológicas. Los estudios futuros deberán identificar los actuadores moleculares que impulsan las (malas) adaptaciones de estos circuitos para poder atacarlos con fármacos farmacológicos clásicos. Alternativamente, futuros enfoques terapéuticos que involucren técnicas de modulación cerebral podrían aprovechar los hallazgos actuales.

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Descargar referencias

Agradecemos a EJ Kremer y Plateforme de Vectorologie de Montpellier por proporcionar CAV-2-Cre. Agradecemos a Jean-Charles Paterna y Melanie Rauch, así como a las instalaciones de Zurich Vector Core, por proporcionar varios virus dependientes de flippasa. Agradecemos al Dr. Massimo Mantegazza por proporcionar ratones vGAT-Cre. Agradecemos a todo el personal del animalario su apoyo técnico.

Este trabajo fue apoyado por el Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), la Université Côte d'Azur, Labex Signalife, la Fédération pour la Recherche sur le Cerveau y Rotary—Espoir en Tête, la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20180339159) y Agence Nationale de la Recherche (ANR-20-CE37-0017) a JB. LB recibió un doctorado. beca del FRM así como un doctorado de cuarto año. Beca del FRM (FDT201904007874). TC recibió un doctorado de cuarto año. Beca del FRM (FDT202106012968). LR recibió un doctorado. beca del FRM.

Estos autores contribuyeron igualmente: Loïc Broussot, Thomas Contesse.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Sebastián P. Fernández, Jacques Barik.

Universidad Costa Azul, Niza, Francia

Loïc Broussot, Thomas Contesse, Renan Costa-Campos, Leah Royon, Hugo Fofo, Sebastian P. Fernandez y Jacques Barik

CNRS UMR7275, Instituto de Farmacología Molecular y Celular, Valbonne, Francia

Loïc Broussot, Thomas Contesse, Renan Costa-Campos, Leah Royon, Hugo Fofo, Thomas Lorivel, Sebastian P. Fernandez y Jacques Barik

CNRS, IMN, UMR 5293, Universidad de Burdeos, Burdeos, Francia

Christelle Glangetas y François Georges

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LB, TC y LR realizaron experimentos de comportamiento. LB, TC y HF realizaron microscopía. SPF y RCC realizaron grabaciones ex vivo. CG y FG realizaron registros electrofisiológicos in vivo. TL proporcionó apoyo técnico para los análisis de comportamiento. LB, SPF y JB diseñaron el proyecto y escribieron el artículo. Todos los autores proporcionaron comentarios sobre la redacción del artículo.

Correspondence to Sebastian P. Fernandez or Jacques Barik.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Broussot, L., Contesse, T., Costa-Campos, R. et al. Una vía GABAérgica no canónica hacia el VTA promueve la congelación incondicionada. Mol Psiquiatría 27, 4905–4917 (2022). https://doi.org/10.1038/s41380-022-01765-7

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Recibido: 31 de mayo de 2021

Revisado: 09 de agosto de 2022

Aceptado: 22 de agosto de 2022

Publicado: 20 de septiembre de 2022

Fecha de emisión: diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01765-7

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